水解单宁酸脱除绿茶提取液中咖啡因的研究

范玉文，聂珂楠，李婷，王玉丽，吴正奇*

湖北工业大学生物工程与食品学院（武汉 430068）

茶叶是世界性饮品，中国是世界茶叶生产和消费的第一大国[1]。据中国茶叶流通协会统计[2]，2022年我国茶园总面积320万 hm2。根据加工方法的不同，茶叶可分为绿茶、红茶、白茶、乌龙茶和普洱茶[3]，其中绿茶是主要的茶种[4]。根据研究显示，绿茶中茶多酚15%～30%[5]，咖啡因（caffeine，CAF）2%～5%[6]，以茶氨酸为代表的氨基酸1%～2%[7]，茶多糖1%～5%[8]，水溶性果胶0.5%～1%[9]，可溶性灰分3%～4%[10]。在茶多酚中，以表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechingallate，EGCG）为代表的儿茶素（catechin）占比60%～80%，而EGCG占儿茶素的55%～70%[11]。绿茶为非年份茶，保存期的延长，其品质、风味和颜色会发生较快的劣变[12]。随着饮茶人口持续减少，绿茶出现较严重的积压[13]，因此，对绿茶的精深加工研究，拥有重要的意义。

中国和日本规定绿茶茶粉中咖啡因含量低于1%[14]。因为过量咖啡因对人体健康具有多方面的不利作用[15-16]，所以脱咖啡因技术尤为重要，方法主要包括超临界流体脱除法[17-18]、热水脱除法[19]、乳酸乙酯脱除法[20-21]和各种吸附法[22-24]。单宁酸包括水解单宁酸（也称水解型单宁酸）和缩合单宁酸（也称缩合型单宁酸）2种类型，其中缩合型单宁酸对人体有毒[25]，不能用于食品中。此次试验将利用咖啡因与水解单宁酸生成沉淀性的咖啡因-水解单宁酸复合物的性质，脱除绿茶提取液中咖啡因。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

绿茶（市售）。

色谱级乙酸（上海麦克林生化科技有限公司）；色谱级甲醇、色谱级乙腈、分析纯乙醇、分析纯氢氧化钠（国药集团化学试剂有限公司）；咖啡因（CAF）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、儿茶素没食子酸酯（ECG）、没食子儿茶素（EGC）、儿茶素（EC）和没食子酸（GA）：上海甄准生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

ME104E/02型电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；DK-S22型电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；RJ-TGL-16G离心机（武汉递热爱生物科技有限公司）；84-1A型磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）；200～1 000 μL大龙移液枪（大龙新创实验仪器有限公司）；1 000～5 000 μL大龙移液枪（大龙新创实验仪器有限公司）；Uitimate 3000型高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

1.3 分析方法

1.3.1 CAF和EGCG等主要儿茶素标准曲线的制定

测定方法参照侯丹[26]的方法。

标准溶液的制备：准确称量一定量CAF和EGCG标准品，分别配制质量浓度为2 000 μg/mL的CAF和EGCG水溶液，作为母液；分别吸取0.5，1，2.5和5 mL母液，加水定容至10 mL，得到100，200，500，1 000和2 000 μg/mL的CAF和EGCG溶液，混匀离心，过0.22 μm滤膜，待测。

测定方法：C18柱（5 μm，4.6 nm×250 mm），流动相：A相为2%乙酸、B相为乙腈、C相为甲醇、D相为10%甲醇；流速为1 mL/min；进样量为10 μL；在280 nm处检测；柱温为40 ℃；洗脱方式：B相由6.5%变化15%（0～16 min），再从15%变化25%（16～25 min），最后25%变化6.5%（25～30 min）。以标准品的峰面积（mAU·min）为纵坐标，质量浓度（500 μg/mL）为横坐标，绘制得到标准曲线。

1.3.2 绿茶提取液中CAF和EGCG等主要儿茶素含量的测定

绿茶与水按1∶15质量比混合，在80 ℃水浴中搅拌浸提0.5 h后，经3层纱布过滤得粗滤的绿茶提取液，离心10 min（8 500 r/min），弃沉淀得上清液，按1.3.1的方法测定上清液中CAF和EGCG等主要儿茶素含量。

1.3.3 CAF脱除率、EGCG损失率和相对分离度的计算

根据式（1）～（3）计算CAF脱除率、EGCG损失率及相对分离度。

式中：X为原始绿茶提取液中咖啡因含量，μg；X0为水解单宁酸脱咖啡因处理后绿茶提取液中咖啡因含量，μg；Y为绿茶提取液中EGCG含量，μg；Y0为水解单宁酸脱咖啡因处理后绿茶提取液中EGCG含量，μg。

1.4 试验方法

1.4.1 水解单宁酸脱咖啡因的水解单宁酸溶液最佳添加比例的确定

取5份浓缩比1/3的绿茶浓缩液，水解单宁酸溶液（质量浓度5%）添加比例（体积比）分别控制为绿茶浓缩液体积的5%，10%，15%，20%和25%，在pH 5.5（绿茶浓缩液的固有pH 5.5）和温度25 ℃的条件下各搅拌10 min后，分别离心，取上清液，稀释到原来的浓缩倍数，经0.22 μm膜过滤，按照1.3.1～1.3.3的方法分别测定滤液中CAF、EGCG和其他儿茶素单品含量，计算CAF脱除率、儿茶素损失率和相对分离度。根据相对分离度，确定水解单宁酸脱咖啡因的水解单宁酸溶液最佳添加比例。

1.4.2 水解单宁酸脱咖啡因的最佳搅拌时间的确定

取5份浓缩比1/3的绿茶浓缩液，各加入1.4.1确定的最佳比例的水解单宁酸溶液，在pH 5.5和温度25 ℃条件下，分别搅拌10，20，30，40和50 min后，分别离心，取上清液，稀释到原来的倍数，经0.22 μm膜过滤，按照1.3.1～1.3.3的方法分别测定滤液中CAF、EGCG和其他儿茶素单品含量，计算CAF脱除率、儿茶素损失率和相对分离度。根据相对分离度，确定水解单宁酸脱咖啡因的最佳搅拌时间。

1.4.3 水解单宁酸脱咖啡因的最佳温度的确定

取5份浓缩比1/3的绿茶浓缩液，各加入1.4.1确定的最佳比例的水解单宁酸溶液，控制pH 5.5，分别在25，35，45，55和65下搅拌1.4.2确定的最佳搅拌时间后，分别离心，取上清液，稀释到原来的倍数，经0.22 μm膜过滤，按照1.3.1～1.3.3的方法分别测定滤液中CAF、EGCG和其他儿茶素单品的含量，计算CAF脱除率、儿茶素损失率和相对分离度。根据相对分离度，确定水解单宁酸脱咖啡因的最佳温度。

1.4.4 水解单宁酸脱咖啡因的最佳pH的确定

取5份浓缩比1/3的绿茶浓缩液，各加入1.4.1确定的最佳比例的水解单宁酸溶液，pH分别控制为3.5，4.5，6.5和7.5，在1.4.3确定的最佳温度下分别搅拌1.4.2确定的最佳搅拌时间后，分别离心，取上清液，稀释到原来的倍数，经0.22 μm膜过滤，按照1.3.1～1.3.3的方法分别测定滤液中CAF、EGCG和其他儿茶素单品的含量，计算CAF脱除率、儿茶素损失率和相对分离度。根据相对分离度，确定水解单宁酸脱咖啡因的最佳pH。

1.4.5 水解单宁酸脱咖啡因的绿茶提取液的最佳浓缩比的确定

取浓缩比分别为1/2，1/4，1/5和1/6的绿茶浓缩液，各1份，分别加入1.4.1确定的最佳比例的水解单宁酸溶液（按浓缩比作相应的换算，即浓缩比1/2，1/4，1/5和1/6时，水解单宁酸溶液的添加比例分别为10%，20%，25%和30%），控制在1.4.4确定的最佳pH、1.4.3确定的最佳温度下分别按1.4.2确定的最佳搅拌时间搅拌后，分别离心，取上清液，稀释到原来倍数，经0.22 μm膜过滤，按照1.3.1～1.3.3的方法分别测定滤液中CAF和EGCG含量，计算CAF脱除率、EGCG损失率和相对分离度。根据相对分离度，确定水解单宁酸脱咖啡因的绿茶提取液的最佳浓缩比。

2 结果与分析

2.1 绿茶提取液中咖啡因和儿茶素含量的结果分析

绿茶提取液中儿茶素类物质（GA、ECG、EGCG、EC和EGC）和CAF的含量见表1。结果表明，绿茶提取液儿茶素类物质中，以EGCG含量最高，达5.012 mg/mL，占总儿茶素含量比例达52.3%，是绿茶提取液中主要的儿茶素，也是抗氧化活性最强的儿茶素。绿茶提取液中CAF含量较高，达1.503 mg/mL，相当于EGCG含量的30.0%，占儿茶素总量的15.7%，所以有必要脱除咖啡因，以减少咖啡因的含量。在脱除绿茶提取液中CAF的同时，应尽可能保留EGCG，提高相对分离度，减少EGCG损失。

表1 绿茶中咖啡因和儿茶素含量 单位：mg/mL

2.2 水解单宁酸溶液添加比例对CAF脱除率、EGCG损失率和相对分离度影响的结果分析

水解单宁酸溶液添加比例对CAF脱除率、EGCG损失率和相对分离度影响见图1。结果表明，水解单宁酸添加比例的不同对CAF的脱除效果也不同，同时对EGCG的损失也有一定影响。CAF脱除率随着水解单宁酸添加比例的增大呈现先上升后下降趋势；EGCG损失率呈现先持续上升趋势。水解单宁酸与绿茶提取液中咖啡因反应时，水解单宁酸添加比例过小，只能与绿茶提取液中部分咖啡因形成沉淀性的单宁酸-咖啡因复合物，导致咖啡因的沉淀不充分和脱除率较低；随着水解单宁酸添加比例的增大，咖啡因的脱除率也随之增大，这是因为在反应过程中生成较多的沉淀性的单宁酸-咖啡因复合物，咖啡因的沉淀比较充分和脱除率较大。但是，水解单宁酸添加比例过大，由于水解单宁酸含有较多的酚羟基和羧基，呈现较强的酸性，过量水解单宁酸会与已形成沉淀的水解单宁酸-咖啡因复合物以氢键、配位键和离子键结合，生成可溶性的水解单宁酸-咖啡因-水解单宁酸复合物，使原本沉淀后的单宁酸-咖啡因复合物重新溶解，导致咖啡因的脱除率下降。同时，在反应过程中过量的水解单宁酸也会与以EGCG为代表的儿茶素以氢键的方式聚合形成不溶性的水解单宁酸-儿茶素复合物，从而使EGCG的损失率增大，导致在咖啡因脱除率降低的同时，增大EGCG损失率。水解单宁酸溶液添加比例15%时，CAF脱除率为75%，EGCG损失率是21%，相对分离度达到最大，为3.2。因此，水解单宁酸脱咖啡因的水解单宁酸溶液最佳添加比例为15%。

2.3 搅拌时间对CAF脱除率、EGCG损失率和相对分离度影响的结果分析

搅拌时间对CAF脱除率、EGCG损失率和相对分离度影响见图2。结果表明，随着搅拌时间的增长，CAF脱除率呈现上升趋势，EGCG损失率也随着搅拌时间的增长呈现持续上升趋势。搅拌时间的不同对CAF的脱除效果也不同，但CAF脱除率都在70%以上，同时对EGCG的损失也有一定影响。搅拌时间对咖啡因脱除率和EGCG损失率有一定影响，原因可能是搅拌时间的增加，会增多空气中氧气的溶入，加速以EGCG为代表的儿茶素的氧化和聚合，生成不溶性的沉淀，从而导致EGCG损失率增高。搅拌时间10～20 min时，EGCG损失率影响很小，但随着时间的增长，EGCG损失率逐渐增大。常温下增加搅拌时间也会使茶叶提取液中其他物质与茶多酚形成沉淀[27]，也造成EGCG损失，导致EGCG损失率升高。搅拌时间20 min时，CAF脱除率87%，EGCG损失率32%，相对分离度达到最大，为5.2。因此，水解单宁酸脱咖啡因的最佳搅拌时间为20 min。

图2 搅拌时间对咖啡因脱除率、儿茶素损失率和相对分离度的影响

2.4 温度对CAF脱除率、EGCG损失率和相对分离度影响的结果分析

温度对CAF脱除率、EGCG损失率和相对分离度影响见图3。结果表明，CAF脱除率随着温度的增高呈现缓慢上升趋势，EGCG损失率随着温度的增高呈现持续上升趋势。温度的不同对CAF脱除效果影响较小，CAF脱除率都在80%以上，但对EGCG损失的影响较大。温度对CAF脱除率影响不大，这是因为水解单宁酸-咖啡因复合物的溶解度不太随温度的升高而增大，同时温度升高，有利于破坏咖啡因与EGCG通过配位键形成的“冷后浑”[28]，使咖啡因处于游离状态。温度25～35 ℃时，EGCG损失率不大，但是温度35 ℃以上，EGCG损失率大幅增加，可能是由于温度升高会加剧EGCG的氧化聚合生成不溶性的聚合物，此外，随着温度的升高，也加剧绿茶提取液中儿茶素与其他大分子物质之间的聚合，形成不溶性的聚合物，进一步促进EGCG损失率的增加。温度越高，儿茶素类物质的结构在高温下容易被破坏[29]，同时茶多酚越容易氧化。温度35 ℃时，CAF脱除率87%，EGCG损失率34%，相对分离度达到最大，为5.1。因此，水解单宁酸脱咖啡因的最佳温度为35 ℃。

2.5 pH对CAF脱除率、EGCG损失率和相对分离度影响的结果分析

pH对CAF脱除率、EGCG损失率和相对分离度影响见图4。结果表明，pH的不同对CAF脱除率和EGCG损失率有一定影响。CAF脱除率随着pH的增大呈现先上升后下降的趋势；EGCG损失率随着pH的增大呈现上升趋势。水解单宁酸与咖啡因形成复合物时存在适宜的pH，由于咖啡因是碱性物质，pH太低时，少量的咖啡因会与低pH下过多的H+反应，以易溶于水的咖啡因盐酸盐形式存在，不能够与单宁酸形成不溶性的复合物。相反的，pH太高时，水解单宁酸的羧基或酚羟基被中和成阴离子，因此水解单宁酸无法提供足量的H+与咖啡因结合生成复合物沉淀，同时在碱性条件下EGCG上的酚羟基容易被碱氧化形成相应的醌类的有色物质，多酚物质在碱性条件下容易氧化。pH 3.5～5.5时，CAF脱除率持续上升，但随着pH的升高，CAF脱除率开始明显的下降。pH 5.5时，CAF脱除率最高，为87%，EGCG损失率为30%，相对分离度达到最大，为5.4，说明在微酸性条件EGCG损失率低[30]。因此，水解单宁酸脱咖啡因的最佳pH为5.5。

图4 pH对咖啡因脱除率、儿茶素损失率和相对分离度的影响

2.6 浓缩比对CAF脱除率、EGCG损失率和相对分离度影响的结果分析

浓缩比对CAF脱除率、EGCG损失率和相对分离度影响见图5。结果表明，浓缩比对CAF脱除率、EGCG损失率和相对分离度具有不同的影响。浓缩比（浓缩倍数）1/2～1/4时，咖啡因脱除率和相对分离度随浓缩比的增大而上升，而EGCG损失率呈现相对不变或波动；浓缩比1/4～1/6时，咖啡因脱除率随浓缩比的增大而下降，尽管EGCG损失率随浓缩比的增大呈现出减小趋势，但相对分离度随浓缩比的增大表现较快降低的趋势，也就是浓缩比太大，不利于EGCG的保留。这可能是由于随着绿茶提取液浓缩比的增加，绿茶提取液浓度增大，浓缩液中茶多糖和果胶含量的增大导致绿茶提取液中黏度增大，浓度和黏度的增大，不利于水解单宁酸与咖啡因形成复合物，导致相对分离度的下降。同时由于浓缩液中含有金属离子，随着浓缩倍数的增大和浓度的增加，金属离子和茶多糖也会与茶多酚形成沉淀，从而导致以EGCG为代表的儿茶素的损失率增大。浓缩比1/4时，CAF脱除率88%、EGCG损失率25%，相对分离度达到最大，为6.3。因此，水解单宁酸脱咖啡因的最佳浓缩比为1/4。

3 结论

根据水解单宁酸能专一性地与绿茶提取液中咖啡因生成沉淀性的咖啡因-水解单宁酸复合物的性质，选择性地脱除咖啡因和保留以EGCG为代表的儿茶素，以期达到制备无咖啡因或者低咖啡因含量的绿茶茶粉的目的。通过单因素试验，优化水解单宁酸溶液脱除绿茶提取液中咖啡因和保留以EGCG为代表的儿茶素的适宜工艺参数，在水解单宁酸溶液添加比例为浓缩液体积的20%、搅拌时间20 min、温度35 ℃、pH 5.5和浓缩比1/4条件下，咖啡因脱除率为88%，EGCG损失率为25%，相对分离度为6.3。由于水解单宁酸为天然的无毒物质，而且具有抗寄生虫、抗氧化、抗菌等多种生物活性，因此，试验结果具有一定应用价值。今后可对水解单宁酸与咖啡因生成沉淀性的咖啡因-水解单宁酸复合物的机理、水解单宁酸与以EGCG为代表的儿茶素相互作用的机制和水解单宁酸脱除咖啡因工艺参数的多因素正交优化等方面展开进一步研究，以提高咖啡因脱除率，减小EGCG损失率，提高咖啡因与EGCG相对分离度。