不同提取方法对水飞蓟油挥发性化合物的影响

马静，韩黎晓，刘龙龙，张华*

1.延边大学农学院（延吉 133002）；2.锡林郭勒职业学院（锡林浩特 026000）

水飞蓟油是一种从干燥水飞蓟种子中提取出来的新型植物食用油，作为提取水飞蓟素的副产品，并未得到充分开发利用[1]。因此，有必要区分不同提取方法水飞蓟油的挥发性有机化合物的组成和鉴定质量优劣。

水飞蓟油的提取方法主要有机械压榨法、水代法、生物酶辅助提取油法等[2-4]。机械压榨法会降低食用价值[5]，水代法操作难度大[6]，超临界萃取和临界萃取对设备要求高[7-8]。生物酶辅助提取油法通过酶降解细胞壁从而释放油脂，得到的油脂品质好、得率高[9]。

由于水飞蓟油油脂的质量优劣不济，近年来虽然也有将电子鼻技术[10-11]、红外光谱[12]、核磁共振[13]等技术区分油脂质量，但很难从分子的角度判别油脂质量。胡谦等[14]采用UPLC-QTOF-MS技术通过对甘油酯的分析，从而对压榨油和浸出油进行鉴别；Kurata等[15]通过电喷雾电离质谱快速鉴别42种植物油的脂肪酸组成。

基于顶空固相微萃取-气相色谱-质谱（HS-SPMEGC-MS）用于区分酶法提取、溶剂提取和压榨水飞蓟油的挥发性有机化合物的组成和鉴定质量优劣研究尚未见诸报道。因此，试验基于HS-SPME-GC-MS技术，比较不同提取方法的水飞蓟油的挥发性化合物。结合无监督的多变量统计方法PCA、有监督的多变量统计方法PLS-DA和灰度关联分析法区分不同方法提取的水飞蓟油，并确定其质量优劣。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

水飞蓟籽（安徽亳州鸿硕生物科技有限公司）；冷榨水飞蓟油（延边远山油脂有限公司）。

无水乙醇、正己烷，均为分析纯，阿拉丁试剂（上海）有限公司。

1.2 主要仪器与设备

QP2010 Plus气相-质谱联用仪（配有电喷雾离子源，日本岛津公司）；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头（美国Supelco公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 水飞蓟油的制备

取500 g水飞蓟籽放入粉碎机进行粉碎，粉碎后过0.180 mm（80目）筛，取100 g水飞蓟籽粉末与300 mL溶液（正己烷-无水乙醇2∶1，V/V）混合置于1 000 mL锥形瓶中，添加3 mg/mL纤维素酶，在pH 4.5，45 ℃反应120 min后，于25 ℃恒温摇床振荡提取1 h，过滤，于55 ℃保持旋转蒸发除去溶剂，转移至样品保存瓶中，氮气吹干溶剂，得到水飞蓟油样品A（SMOA）。添加相同量正己烷后，在25 ℃摇床反应2 h后，重复上述操作，得到水飞蓟油样品B（SMOB）。另外，冷榨水飞蓟油样记为C（SMOC）。

1.3.2 样品前处理

准确移取2.0 g油样置于10 mL带有隔垫的瓶盖的顶空瓶中，密封，在60 ℃条件下搅拌平衡10 min，通过隔垫将已老化好的50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头插入顶空瓶中距离液面1 cm处，吸附60 min，待气相色谱-质谱联用分析。

1.3.3 色谱条件

DB-5MS毛细管色谱柱（0.25 μm，30 m×0.25 mm），进样口温度250 ℃，进样方式为不分流，载气为氦气（He），柱流速1 mL/min，吹扫流量3.0 mL/min，分流比50∶1。升温程序：起始温度 40 ℃，保持10 min，以5 ℃/min升至200 ℃，以20 ℃/min升至280 ℃，保持5 min。

1.3.4 质谱条件

离子源（EI）温度200 ℃，接口温度280 ℃，溶剂延迟时间2 min，电子能量70 eV，扫描质量范围（m/z）40～550。利用质谱谱库为NIST08和NIST08s质谱库进行检索，结果选择匹配度≥95%的物质进行分析。

1.4 数据分析

通过Microsoft Excel 2016数据处理系统，运用面积归一化法求得各挥发性成分的相对含量，将Metabioanalysis 5.0用于数据分析、PCA和PLS-DA模型的建立。

2 结果与分析

2.1 不同提取方法的水飞蓟油中挥发性化合物的GC-MS分析

采用HS-SPME-GC-MS对不同提取方式的水飞蓟油的挥发性有机化合物进行分析和鉴定，其结果如表1所示。共确定挥发性有机物43种，其中主要包括酯类9种、酸类4种、醇类6种、烷烃类12种、烯烃2种，醛类2种、吡嗪1种、其他类7种。3种样品中SMOA的香气最为浓郁，而SMOC的香气最淡。SMOA中含有较高的4-羟基丁酸乙酰酯，4-羟基丁酸内酯和N-羟基苯甲酸甲酯等酯类物质，这类物质有浓郁的麦香和奶油的香气。但浓度一定时，感觉阈值越低的化合物越容易被感知；感觉阈值一定时，浓度越高的化合物越容易被感知。从某一物质的含量判断其是否为油脂中主要香气成分不可靠，因此需进行数据降维，排除众多化学信息共存时发生互相重叠的现象，根据主成分因子在不同样本中不同的贡献率从而评价样本之间的规律性和差异性[21-22]。

表1 水飞蓟油易挥发性有机化合物相对含量

2.2 不同提取方法的水飞蓟油中挥发性化合物的GC-MS分析

2.2.1 基于PCA对不同提取方法的水飞蓟油的区分

随着信息技术的不断发展，多元统计技术被广泛应用于油脂各个领域。利用水飞蓟油中有机挥发物含量进行PCA，如图1所示。共获得5个PC，累计R2=0.81，Q2=0.63，表明该模型拟合程度较好，预测能力较好，能够很好地显示样品间的差异，PC1的方差贡献率为85.2%，PC2的方差贡献率为9.9%，2个主成分的贡献率达95.1%，可以很好地代表样品的所有信息。从样品的离散和聚集程度上看，SMOA在PC1上与SMOB和SMOC有很大的区分，无重叠部分，PCA属于无监督分析方法，不能忽略组内误差、消除与研究目的无关的随机误差，因此，并不能直接区分不同提取方法的水飞蓟油，因此，采用有监督的PLS-DA进行进一步研究。PLS-DA是有监督的分析，它可以弥补PCA的不足，消除组内差异，强化组间差异，量化特征化合物造成组分差异的程度[23]。建立PLS-DA模型前，为调整系统的样本之间的差异对样本进行总合归一化处理，数据采用log对数处理。

图1 基于水飞蓟油的PCA得分图

2.2.2 基于PLS-DA对不同提取方法的水飞蓟油的区分

如图2（a）所示，采用置换检验对PLS-DA模型进行验证，重复100次，以获取随机模型的R2和Q2，可作为衡量模型是否过拟合的标准，结果显示该模型并未出现过拟合现象（P＜0.01），模型可靠。如图2（b）所示，验证获得随机的R2和Q2，R2=0.99，Q2=0.97，表明模型不但准确可靠，且具有良好的预测能力，可用于解释不同水飞蓟油之前的挥发性有机物的差异。图3为不同提取方法的水飞蓟油PLS-DA得分图，图3显示SMOA与SMOB和SMOC存在显著差异，这一结果与PCA分析结果一致。

图2 不同水飞蓟油的置换检验图（a）和置换保留图（b）

图3 不同水飞蓟油的PLS-DA得分图

2.2.3 不同水飞蓟油的挥发性特征标志物的筛选与分析

基于PLS-DA分析结果，可用变量重要性投影（variable important for the projection，VIP）可量化PLS-DA的每个变量对分类的贡献，在统计学上，一般将VIP值大于1表示在判别过程中具有重要作用，VIP值越大，样本间差异越大[24]。如图4所示，共筛选出14种潜在挥发性标志物，其中有酯类4种、醇类2种、烷烃类3种。为更加直观地观察不同水飞蓟油挥发性标志物，根据每个挥发性有机物的相对含量绘制热图，如图5所示，SMOB和SMOC聚为1类，SMOA单独为1类。由图4可以看出，在VIP值大于1的物质中，SMOA中三甲基乙腈、新戊二醇、醋酸2-乙基乙酯、甲環丁烷和4-羟基丁酸内酯含量较高，是区分其他2组的主要标志物。而SMOB中3-甲基3-苯基苯甲酸酯含量较高，是区分其他2组的重要标志物。SMOC中季铵盐-78, 2-乙基对二甲苯和环辛四烯含量较高，是区分其他2组的重要标志物。SMOA中酯类物质含量较高，且风味阈值较低，在SMOA中起着重要的作用，因此SMOA的味道更加浓郁。

图4 不同提取方法的水飞蓟油的VIP图

图5 不同方法提取水飞蓟油挥发性标志物的热图

2.3 灰度关联分析法判别水飞蓟油质量

灰度关联分析法对系统发展变化态势提供量化的度量标准，根据关联度的结果比较不同因素对整体样本的影响[25]。为进一步明确3种不同提取方式的水飞蓟油的质量优劣，运用灰度关联分析法对VIP值大于1的物质进行统计分析。按式（1）计算。

式中：i=1, 2, 3分别表示SMOA，SMOB和SMOC对14组VIP值大于1的挥发性标志物的数据均值化处理。

利用式（2）求得绝对差值。

依据式（3）求出关联系数，式中ρ为分辨系数，取0.5，关联系数结果见表2。

表2 关联系数结果表

计算出各挥发物的权重，将权重带入综合评分式（5）。

不同提取方式的水飞蓟油综合评分见表3。结果表明，SMOA的挥发性标志物综合评分最高，说明由酶法提取的水飞蓟油气味最优，其次是SMOB，气味最差的是SMOC，这一结果水飞蓟油的气味优劣与提取方式密切相关。

表3 不同方式所得水飞蓟油挥发性特征物的综合评分

3 结论

采用UPLC-QTOF-MS对不同方法提取的水飞蓟油挥发性有机化合物进行检测，共分析出43种挥发性有机物，其中酯类9种、酸类4种、醇类6种、烷烃类12种、烯烃2种、醛类2种、吡嗪1种、其他类7种。结合多元统计方法分析得出VIP大于1的挥发性物质14种，对SMOA有重要影响的5种，SMOB中1种、SMOC中3种，SMOA挥发性香气物质含量最高，含有较高的4-羟基丁酸乙酰酯、4-羟基丁酸内酯和N-羟基苯甲酸甲酯等。结合灰度关联分析法可知：SMOA关联度0.808，油脂质量最佳；SMOB关联度0.711，油脂质量次之；SMOC关联度0.703，油脂质量最差；说明由酶法提取的水飞蓟油气味最优。因此，酶法辅助复合溶剂提取水飞蓟油可最大程度地保留油脂中挥发性成分，香气最为浓郁。我国水飞蓟油提取率仍较低，应用规模较小，提取出的产品质量也较差，因此水飞蓟油酶提取法提取及运用有着重要意义。