反式-2-己烯醛与可溶性盐联用对柑橘酸腐病菌和酸腐病的抑制作用

欧阳秋丽，吴垚焱冰，刘洋梅，葛云舒，陶能国，袁星星

（湘潭大学化工学院，湖南 湘潭 411105）

柑橘酸腐病菌（Geotrichum citri-aurantii）侵染引起的酸腐病是最严重的柑橘果实采后病害之一。酸腐病易在雨后、重雾或露水未干时采收的柑橘上发生，且一旦发生，发病范围快速扩大，给柑橘产业带来巨大冲击[1-2]。目前，已注册的商用杀菌剂仅有邻苯基苯酚钠盐、双胍盐和丙环唑可部分防治酸腐病，但这些传统杀菌剂存在化学毒性，极易污染环境，且易导致柑橘果实油斑病暴发等问题[3-5]。因此，寻找可替代化学杀菌剂的活性物质或替代方案成为近年来柑橘采后病害研究的热点之一。

多项研究表明，植物精油及其抑菌组分对酸腐病菌等多种柑橘采后致病真菌有显著的抑制作用，且具有安全、高效、低残留等优点，具备控制酸腐病害的潜力[6-8]。反式-2-己烯醛天然存在于香茅油、樟脑油等中，是植物精油的挥发性组分，也是植物对外界环境应答防御的重要信号分子。研究表明，反式-2-己烯醛对链格孢菌、圆弧青霉、扩展青霉、灰葡萄孢菌等多种采后致病菌有良好的抑制效果[9-14]，通过破坏真菌的细胞膜完整性[9-11]以及抑制真菌能量代谢[14]发挥其抑菌性能。前期研究发现，反式-2-己烯醛对酸腐病菌有明显的抑制作用，最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）和最小杀菌浓度（minimal fungicidal concentration，MFC）分别为0.42 mg/mL和0.85 mg/mL。贮藏7 d时，10×MFC反式-2-己烯醛处理组的‘宫川’柑橘果实发病率相较于对照组降低了67%，说明反式-2-己烯醛是一种潜在的生物杀菌剂[15]。但反式-2-己烯醛价格较高且气味浓郁，其实际应用受到限制。

可溶性盐主要通过破坏真菌细胞壁和细胞膜、破坏重要酶系统的作用和干扰能量传递以及遗传机制，从而干扰真菌的正常生长[16-17]。食品添加剂中一系列低毒的可溶性盐，如脱氢乙酸钠、丙酸钙、苯甲酸钠、山梨酸钾等，对多种果蔬病原微生物有显著抑制作用，已被报道可应用于柑橘、梨、苹果、桃、葡萄等水果的采后病害防治，是一类可靠的低毒有效杀菌剂[17-19]。食品添加剂双乙酸钠、丙酸钙、磷酸钠等也被发现有良好的抑菌效果[20-22]。用质量分数0.4%的双乙酸钠清洗鲜切生菜后，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和肠炎沙门氏菌分别减少了1.92、1.57（lg（CFU/mL））和1.42（lg（CFU/mL））[21]。丙酸钙具有一定的抗菌活性，在酸性条件下能够抑制细菌和霉菌的生长[22]。磷酸钠能有效控制食源性细菌病原体的生长，包括沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特氏菌，对果蔬采后病原菌粉红单端孢的菌丝生长和孢子萌发也有较好的抑制作用[16]。实验室前期研究发现脱氢乙酸钠对柑橘采后酸腐病有较好的防控效果，在离体条件下，其对酸腐病菌的MIC＝MFC＝0.80 mg/mL，在活体实验中，质量浓度为4×MFC的脱氢乙酸钠可有效抑制柑橘果实酸腐病的发生，具有良好的应用潜力[23]。

长期使用一种杀菌剂容易导致病原菌产生抗性，降低药效，而抑菌物质联用可以有效提高抑菌效果并降低病原菌的抗性[24-29]。茶皂素与低剂量的咪鲜胺或抑霉唑混合使用提高了其对接种‘沙糖’柑橘果实青霉病、绿霉病或酸腐病的防治性能[5]。肉桂醛和柠檬醛联用后对酸腐病菌的抑制效果优于二者单独作用，可有效地延长柑橘的货架期[27]。月桂精油与碳酸氢钠联用可以显著提升月桂精油的抑菌效果，250 μg/mL月桂精油＋质量分数1%的碳酸氢钠处理可以完全抑制链格孢生长，500 μg/mL月桂精油与质量分数1%的碳酸氢钠联用能显著降低樱桃番茄的发病率[28]。植物精油有良好的抑菌效果，但成本相对较高。将植物精油与低价的可溶性盐进行联用，可能提高抑菌效果并降低使用成本。因此，探讨可溶性盐与反式-2-己烯醛联用效果对开发安全有效、价格低廉的果蔬防腐保鲜剂具有重要意义。

本研究主要探讨反式-2-己烯醛与可溶性盐如双乙酸钠、磷酸钠、丙酸钙、脱氢乙酸钠等联用对柑橘酸腐病菌的抑制作用，以期为柑橘贮藏期病害的可持续治理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株、材料与试剂

柑橘酸腐病菌（G.citri-aurantii）菌株分离自腐烂的温州蜜柑果实，已通过形态学和分子鉴定，现保存于湘潭大学生物与食品工程专业实验室，在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）上保存待用。

湘西椪柑（Citrus reticulataBlanco cv.Ponkan）果实于2020年12月21日从湖南省泸溪县张家坪村果园采摘，选择大小均一、着色均匀且无病斑果实作为实验材料。

反式-2-己烯醛（98%）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。所有化学药品均为分析级。

1.2 仪器与设备

SPX-250B生化培养箱、MLS-3020手提式压力蒸汽无菌器 上海博迅实业有限公司；SCW-CJ-1F垂直流洁净工作台 苏州安瑞净化科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 可溶性盐单独处理对柑橘酸腐病菌的抑制效果

采用琼脂稀释培养法[29]测定双乙酸钠、磷酸钠、丙酸钙对柑橘酸腐病菌菌丝体生长的影响。双乙酸钠、磷酸钠、丙酸钙终质量浓度分别为0（对照）、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00 mg/mL。每个培养皿中心接种1 个直径为6.0 mm的菌饼，在（28±2）℃恒温培养箱培养96 h，每24 h测量其生长直径，并计算其抑制率。MIC为培养48 h时完全没有生长的最低质量浓度，MFC为生长96 h时完全没有生长的最低质量浓度。对照组中加入相应体积的吐温80（体积分数0.5%）。柑橘酸腐病的抑制率按式（1）计算。

式中：dc为对照组生长直径/mm；dt为处理组生长直径/mm。

1.3.2 反式-2-己烯与可溶性盐联用对柑橘酸腐病菌生长的影响

用1.3.1节方法测定反式-2-己烯分别与脱氢乙酸钠、双乙酸钠、磷酸钠、丙酸钙联用对柑橘酸腐病菌菌丝体生长的影响。反式-2-己烯醛和脱氢乙酸钠、双乙酸钠、磷酸钠、丙酸钙以质量比0.849∶1.000进行复配，复配物的终质量浓度为0、0.12、0.23、0.46、0.92 mg/mL。

采用分数抑制浓度（fractional inhibitory concentration，FIC）[30]评定反式-2-己烯与可溶性盐的联用效果。当FIC≤0.5时，两种物质为协同作用；0.5＜FIC≤1则为相加作用；1＜FIC≤4为无关作用；FIC＞4为拮抗作用。FIC按公式（2）计算。

式中：MICa,联用表示MIC下两物质联用时反式-2-己烯的质量浓度；MICa,单用表示单独使用反式-2-己烯时的MIC；MICb,联用表示MIC下两物质联用时可溶性盐的质量浓度；MICb,单用表示单独使用可溶性盐时的MIC。

1.3.3 反式-2-己烯与可溶性盐联用对柑橘酸腐病发生的影响

反式-2-己烯与可溶性盐联用对柑橘酸腐病发生的影响参照Ouyang Qiuli等[27]的方法。浸泡液配制：将反式-2-己烯分别与不同的可溶性盐均匀溶于含吐温80（体积分数0.5%）的水溶液中，最终反式-2-己烯与各可溶性盐联用的质量浓度分别为0、1×MFC、5×MFC和10×MFC。

椪柑用自来水洗净后，在体积分数2%的次氯酸钠溶液中浸泡2 min，用蒸馏水洗净并自然晾干。晾干后的椪柑用无菌手术刀在赤道处对称划2 个伤口（3 mm×2 mm）。接种浓度为1×105个/mL的柑橘酸腐病菌孢子悬浮液10 μL。接种后的椪柑静置4 h后，在相应浓度的浸泡液中浸泡1 min，对照组为果蜡浸泡组。椪柑贮藏温度为（25±2）℃，相对湿度为85%～90%，每组10 个果实。每天测定椪柑腐烂率和腐烂直径，并通风1 h。发病率按公式（3）计算。

1.4 数据分析

所有实验均重复3 次，采用Excel软件进行数据处理，结果用平均值±标准差表示，采用软件SPSS 16.0软件进行统计分析，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行差异显著性分析（P＜0.05），使用Adobe Photoshop CS6软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 可溶性盐单独处理对柑橘酸腐病菌的抑制作用

由表1可知，双乙酸钠对柑橘酸腐病菌菌丝体的抑制作用随着质量浓度增加而增强。在整个培养时间内，质量浓度低于4.00 mg/mL的双乙酸钠对柑橘酸腐病菌菌丝体的抑制率低于30%，效果不佳；当双乙酸钠质量浓度达到16.00 mg/mL，柑橘酸腐病菌生长被完全抑制，说明双乙酸钠对柑橘酸腐病菌的MIC和MFC均为16.00 mg/mL。

表1 双乙酸钠对柑橘酸腐病菌的抑制率Table 1 Inhibition rates of sodium diacetate on G.citri-aurantii

由表2可知，随着作用质量浓度的增加，磷酸钠对柑橘酸腐病菌的抑制作用逐渐增强。在整个培养时间内，低质量浓度（1.00～2.00 mg/mL）的磷酸钠对柑橘酸腐病菌菌丝体的生长抑制效果随着培养时间延长而效果减弱。培养2 d时，4.00 mg/mL的磷酸钠可完全抑制柑橘酸腐病菌生长；培养4 d时，16.00 mg/mL的磷酸钠可完全抑制柑橘酸腐病菌生长，说明磷酸钠对柑橘酸腐病菌的MIC和MFC分别为4.00 mg/mL和16.00 mg/mL。

表2 磷酸钠对柑橘酸腐病菌的抑制率Table 2 Inhibition rates of sodium phosphate on G.citri-aurantii

由表3可知，在整个培养过程内，1.00～16.00 mg/mL的丙酸钙对柑橘酸腐病菌的抑制作用较弱。当处理质量浓度达到16.00 mg/mL时，对柑橘酸腐病菌生长的抑制率仅为50.00%～66.28%，说明丙酸钙抑制柑橘酸腐病菌生长的MIC和MFC均高于16.00 mg/mL。

表3 丙酸钙对柑橘酸腐病菌的抑制率Table 3 Inhibition rates of calcium propionate on G.citri-aurantii

2.2 反式-2-己烯与可溶性盐联用对柑橘酸腐病菌生长的影响

如表4所示，反式-2-己烯醛与磷酸钠、双乙酸钠和丙酸钙联用为协同作用（FIC≤0.5），与脱氢乙酸钠联用为相加作用（0.5＜FIC≤1），与单独使用相比，复合使用时反式-2-己烯醛和可溶性盐的使用量均明显降低。反式-2-己烯醛和双乙酸钠联用后，抑制柑橘酸腐病菌生长的MIC＝MFC＝0.23 mg/mL，反式-2-己烯醛和双乙酸钠的用量明显低于单独抑菌时的质量浓度，相较于单独使用时的MIC和MFC，反式-2-己烯醛质量浓度为0.11 mg/mL，双乙酸钠质量浓度为0.12 mg/mL，表明双乙酸钠与反式-2-己烯醛联用后，反式-2-己烯醛的用量减少73.81%～87.06%，双乙酸钠的用量减少99.25%。反式-2-己烯醛与磷酸钠联用显著抑制柑橘酸腐病菌生长（MIC＝MFC＝0.23 mg/mL），此时反式-2-己烯醛和磷酸钠的质量浓度分别为0.11 mg/mL和0.12 mg/mL，相比于单独使用时的MIC和MFC，磷酸钠和反式-2-己烯醛质量浓度分别降低97.00%～99.25%和73.81%～87.06%。反式-2-己烯醛与丙酸钙联用之后MIC＝MFC＝0.23 mg/mL，反式-2-己烯醛用量相比于单独处理时的MIC和MFC减少73.81%～87.06%，丙酸钙质量浓度为0.12 mg/mL，明显低于丙酸钙单独作用时的质量浓度。反式-2-己烯醛和脱氢乙酸钠联用同样可降低物质的单独用量，对酸腐病菌的MIC＝MFC＝0.46 mg/mL（反式-2-己烯醛质量浓度为0.21 mg/mL，脱氢乙酸钠质量浓度为0.25 mg/mL），相比单独使用时的MIC和MFC，反式-2-己烯醛和脱氢乙酸钠分别减少了50.00%～75.29%和68.75%的用量。由以上结果可知，反式-2-己烯醛与可溶性盐联用可大幅增强二者的抑菌效果。

表4 反式-2-己烯与可溶性盐联用抑制柑橘酸腐病菌生长的MIC和MFC值Table 4 MIC and MFC values of trans-2-hexene combined with soluble salts against the growth of G.citri-aurantii

2.3 反式-2-己烯联用可溶性盐对柑橘酸腐病发生的影响

经反式-2-己烯醛联用可溶性盐处理后，接种柑橘酸腐病菌的果实发病率和病斑直径变化分别如表5、6和图1所示。贮藏3 d时，对照组果实开始发病，发病率为（36.67±5.77）%，病斑直径为（4.3±0.6）mm，处理组中，反式-2-己烯醛＋丙酸钙处理组开始发病，但发病率和病斑直径均显著低于对照组（P＜0.05）。贮藏4 d时，对照组发病率达到90%，病斑直径扩大至（14.9±0.3）mm。反式-2-己烯醛＋磷酸钙处理组在4 d时开始发病，在所有已发病的处理组中，1×MFC反式-2-己烯醛＋丙酸钙处理组发病率最高（50.00%），病斑直径（（7.8±0.9）mm）显著低于对照组。贮藏5 d时，反式-2-己烯醛＋双乙酸钠处理组开始发病，处理组中1×MFC和10×MFC反式-2-己烯醛＋丙酸钙发病率最高，分别为（84.07±11.42）%和（86.67±5.77）%，病斑直径分别为（23.2±4.7）mm和（25.1±2.4）mm，发病率与对照组无显著性差异，但病斑直径显著低于对照组。贮藏6 d时，对照组和1×MFC反式-2-己烯醛＋丙酸钙处理组发病率达到1 0 0%，病斑直径分别是（60.6±5.3）mm和（55.6±9.7）mm，除反式-2-己烯醛＋丙酸钙处理组外，其他联用处理组发病率以及病斑直径均显著低于对照组，其中5×MFC和10×MFC反式-2-己烯醛＋脱氢乙酸钠处理组椪柑果实均未发病。

图1 反式-2-己烯醛与可溶性盐联用对接种柑橘酸腐病椪柑果实发病进程的影响Fig.1 Effect of trans-2-hexenal combined with soluble salts on the progression of sour rot disease in ponkan fruit inoculated with G.citri-aurantii

表5 反式-2-己烯醛与可溶性盐联用对接种酸腐病菌椪柑果实的酸腐病发病率的影响Table 5 Effect of trans-2-hexenal combined with soluble salts on the incidence of sour rot disease in ponkan fruits inoculated with G.citri-aurantii

表6 反式-2-己烯醛与可溶性盐联用对接种酸腐病菌椪柑果实病斑直径的影响Table 6 Effect of trans-2-hexenal combined with soluble salts on the lesion diameter of ponkan fruit inoculated with G.citri-aurantii

3 讨论

已有研究表明，反式-2-己烯醛具有显著的抑菌活性和防腐作用，对链格孢菌、尖孢炭疽菌、扩展青霉、灰葡萄孢菌、酸腐病菌等采后病菌具有良好的抑制作用，能有效地控制灰霉病、绿霉病、黑腐病和酸腐病，并对果实品质没有不利影响[9-15]。双乙酸钠、丙酸钙、磷酸钠、脱氢乙酸钠等可溶性盐也具有一定的抑菌效果。双乙酸钠和丙酸钙均可抑制肉制品中枯草芽孢杆菌生长，MIC分别为50 μg/mL和6.25 μg/mL[22]；磷酸钠可抑制果蔬采后病原菌粉红单端孢以及枣、桃果实的褐腐病[16]，不同浓度的磷酸钠处理苹果能够有效控制青霉病，并促进苹果本身营养物质的积累，不影响苹果品质[31]。脱氢乙酸钠对酸腐病菌的MIC＝MFC＝0.80 mg/mL，并对柑橘采后酸腐病有较好的防控效果[15]。本研究结果表明，双乙酸钠、丙酸钙、磷酸钠对柑橘酸腐病菌有一定的抑制效果，具有抑制柑橘采后酸腐病的潜力，其中磷酸钠对酸腐病菌的抑制效果最强。

长期使用单一化学杀菌剂会使病菌产生抗药性，其杀菌作用会大大降低，因此将多种杀菌剂进行复合是目前防治柑橘酸腐病的一种手段。脱氢乙酸钠和硅酸钠按照质量比1∶4进行联用时可以协同抑制酸腐病菌菌丝体生长[24]。双乙酸钠、丁酸钠、丙酸钙和山梨酸钾抑制黄曲霉的MFC分别为32、32、64 mg/mL和128 mg/mL；双乙酸钠与山梨酸钾（质量比为2∶1）联用后对黄曲霉的MFC仅为1 mg/mL，盐类物质的使用量大大减少[25]。本研究发现，离体实验时，可溶性盐单独作用酸腐病菌时抑菌效果较差，但与反式-2-己烯醛联用后其抑菌性能提高且抑菌物质用量降低。反式-2-己烯醛与脱氢乙酸钠复合为相加作用，反式-2-己烯醛＋双乙酸钠、反式-2-己烯醛＋磷酸钠、反式-2-己烯醛＋丙酸钙为协同作用，其中反式-2-己烯醛与双乙酸钠、丙酸钙的联用效果优于其他两种可溶性盐。这与韩乾杰等[26]实验结果一致，丁酸钠对大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌、乳酸菌没有显示出抑菌作用，但不同的植物精油与丁酸钠联用可以协同抑制上述细菌的生长。反式-2-己烯醛和盐类杀菌剂联用后，对酸腐病菌的抑菌效果强于单独杀菌剂作用，推测盐类溶于水后会造成细胞膜两侧渗透压不同，影响细胞膜通透性，加速反式-2-己烯醛进入细胞，加剧细胞损伤。

将肉桂醛和柠檬醛按照1∶2（体积比）的比例混合，用1×MFC混合物处理柑橘果实时，贮藏8 d后的腐烂率仅为60%，而对照组果实已经全部腐烂[27]。百里香精油和不同质量分数的碳酸钠溶液联用，发现1 600 μL/L百里香精油和质量分数0.5%碳酸钠混合可以完全抑制柑橘酸腐病害的发生[29]。与反式-2-己烯醛单独处理相比，5×MFC和10×MFC 反式-2-己烯醛＋脱氢乙酸钠对柑橘酸腐病均有显著的抑制作用，处理组第6天时的果实未发病；10×MFC反式-2-己烯醛＋磷酸钠效果较好，第6天时发病率为（32.78±12.51）%。活体实验所用的反式-2-己烯醛有效质量浓度远高于离体实验的有效质量浓度，可能由于活体实验所用空间较大，反式-2-己烯醛挥发得更快导致有效浓度降低。

综上，反式-2-己烯醛与双乙酸钠、磷酸钠、脱氢乙酸钠联用能够显著抑制酸腐病菌菌丝体生长，降低使用量，并有效控制柑橘采后酸腐病。其中，5×MFC和10×MFC 反式-2-己烯醛＋脱氢乙酸钠防控效果最佳。