挤压处理对淀粉-米谷蛋白复合体系回生特性及流变特性的影响

王丽爽，王可心，岳喜庆，于小帅，肖志刚,2,，王 鹏2,3,

（1.沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866；2.沈阳师范大学粮食学院，辽宁 沈阳 110034；3.华南理工大学食品科学与工程学院，广东 广州 510006）

大米是我国重要的粮食作物，每年产量约为2亿 t[1]。其主要成分大米淀粉约占精米干质量的85%～90%[2]。大米淀粉由葡萄糖分子分别以α-1,4糖苷键及α-1,6糖苷键连接形成的直链淀粉与支链淀粉组成，淀粉分子间通过氢键连接构成大米淀粉的紧密结构[3]。大米淀粉因其颗粒尺寸小、无特殊气味、容易消化等特性而被广泛应用于食品、材料及医药等领域[4]。但在加工和贮藏过程中，大米淀粉内部分子重新趋于有序化排序，直链淀粉间形成重结晶，引起老化回生，导致产品出现变硬、干缩等现象，从而影响食品的品质特性[5]，限制了大米淀粉在食品产业中的应用。因此，采用合理的加工方式来抑制和延缓大米淀粉食品的回生，可以提高大米淀粉在加工贮藏过程中的品质，对提升大米淀粉的应用价值具有重要意义。

目前，酶制剂、乳化剂及化学试剂已经被证明可延缓和抑制淀粉的回生现象[6]，但因存在破坏产品味道及营养价值、安全性低、引入化学及生物试剂等缺点而无法广泛应用。因此，安全天然的改善淀粉回生方法是国内外学者关注的热点。挤压膨化技术是一种常见的物理改性淀粉类食品的方法，具有连续、高效、能耗低、污染小、无化学残留等优点[7]。本课题组前期研究发现，挤压处理后的米糠回生值明显降低，这与挤压过程中高压高剪切环境相关[8]；戚明明等[9]研究发现，挤压破坏了豌豆淀粉的结晶结构，在普鲁兰酶的协同作用下降低了短直链淀粉间的相互作用，从而降低淀粉的回生特性，这些研究表明挤压对延缓淀粉回生具有重要作用。除挤压处理外，有研究发现在淀粉体系中引入蛋白分子（如玉米醇溶蛋白、大豆分离蛋白、乳清蛋白、绿豆蛋白等）可有效降低淀粉凝胶网络强度，并可通过阻碍淀粉分子重新排列的方式延长淀粉体系的老化时间，其性能优于单一体系[10-12]。且Luo Yunmei等[13]发现水稻蛋白对大米淀粉和黄原胶混合物短期、长期老化都具有抑制作用。其中米谷蛋白是水稻蛋白中的优势蛋白，约占总蛋白含量的80%[14]。米谷蛋白核心富含大量的疏水性氨基酸，侧链上有许多亲水性基团（酰胺、羟基、羧基和硫醇），可以通过与淀粉间相互作用而提高混合体系产品的部分性能[15-16]。然而挤压条件下通过米谷蛋白的引入延缓大米淀粉复合物回生效果的研究及影响机制还鲜有报道。因此，本研究通过挤压处理大米淀粉-米谷蛋白混合体系以改善复合体系抗回生特性，并利用多尺度表征技术对挤压处理后大米淀粉与米谷蛋白间的相互作用机理、结构变化及混合物的糊化特性、热力学特性及流变特性等进行分析，探讨挤压处理对延缓复合体系回生特性的作用机制，旨在为淀粉-蛋白复合体系的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大米淀粉（纯度为98.2%，脂肪质量分数0.21%、蛋白质量分数0.46%、灰分质量分数0.33%）、米谷蛋白（纯度为83.1%，脂肪质量分数4.7%、水分质量分数6.5%、灰分质量分数4.9%）江西金农生物科技有限公司；溴化钾（光谱纯）天津市光复精细化工研究所；乙酸（分析纯）、品红酸（分析纯）、明胶、甘油国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

JD2000-2L电子分析天平 沈阳龙腾电子有限公司；DS56-III双螺杆挤压机 济南赛信机械有限公司；FW100粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司；Super3快速黏度分析仪（rapid viscosity analyzer，RVA）美国Newport科技公司；Q20差示扫描量热仪（differential scanning calorimeter，DSC）、DHR-3流变仪 美国TA公司；D8 X射线衍射仪（X-ray diffraction，XRD）德国Bruker公司；Nexus470傅里叶变换红外光谱仪美国Nicolet 公司；JNM-MU 25 型低场核磁共振分析仪 日本电子Datum株式会社；S4800扫描电子显微镜 日本Hitachi公司；AIR激光扫描共聚焦显微镜日本Nikon公司。

1.3 方法

1.3.1 挤压复合物的制备

1.3.2 挤压复合物制备的单因素试验

通过前期预实验，固定挤压机加热一区、二区、四区及五区的温度分别为40、50、20、20 ℃，控制加热三区挤压温度作为影响因素。以回生值为考察指标，选择螺杆转速240、260、280、（300）、320 r/min；挤压温度70、（80）（螺杆转速为变量时）、（90）（物料水分质量分数、大米淀粉/米谷蛋白物料比为变量时）、100、110 ℃；物料水分质量分数32%、（34%）、36%、38%、40%；大米淀粉/米谷蛋白物料比（m/m）95∶5、（93∶7）、91∶9、89∶11、87∶13作为单因素考察范围（括号内的数值为以其他因素为变量时，该指标的确定值）。每个水平重复3 次，取平均值进行统计分析。

1.3.3 糊化特性的测定

参考王玉琦等[17]的方法对样品的糊化特性进行测定。准确称取3.0 g样品加入样品筒中。根据水分校正公式称取一定量的蒸馏水，并利用搅拌器上下快速搅动使样品完全分散在蒸馏水中，利用RVA测定糊化特性，程序设定为：升温50 ℃后保持1 min，再升温到95 ℃保持2 min，最后冷却到50 ℃保持2 min。每个样品重复测定3 次。

1.3.4 热力学特性的测定

精确称取5.0 mg样品放入DSC专用坩埚中，按照1∶7的质量比加入蒸馏水并密封后于4 ℃冰箱中平衡24 h，并与空白坩埚（对照）一起置于仪器样品架上进行扫描[18]。充入流量为40 mL/min的氮气，设定扫描温度范围为20～120 ℃，扫描速率为10 ℃/min。

1.3.5 XRD分析

参考Xie Ying等[19]的方法适当修改，将干燥样品放入带有凹槽的玻璃板上压平后对其进行测定。扫描条件为：在40 kV和40 mA的Cu-Kα辐照下、2θ为5°～40°范围内进行扫描，获得样品的XRD图谱，并利用MDI Jade 6软件进行结晶度分析。

1.3.6 傅里叶变换红外光谱的测定

参考Xiao Zhigang等[20]的方法，分别取适量样品于玛瑙研钵中，按照1∶100的质量比加入溴化钾，在红外灯照射下研磨15 min，将其混合均匀后进行压片。将压片置于傅里叶变换红外光谱仪中进行测定，扣除空气参比背景，设定光谱扫描范围为4 000～400 cm-1，分辨率为2 cm-1，扫描64 次。并利用OMNIC软件对结果进行傅里叶自去卷积处理，分析大米淀粉的短程有序性变化。

1.3.7 低场核磁共振分析

参考裴斐等[21]的方法对样品的自旋-自旋弛豫时间图谱进行测定。采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）序列，参数设置如下：磁场强度为0.5 T，磁场温度为25 ℃，P1（90°脉冲时间）为6.52 μs，P2（180°脉冲时间）为12 μs，TD（采样点）为240 018，SW（频谱宽度）为100 kHz，回波数为4 000，NS（重复扫描次数）为4，TW（重复采样时间）为4 000 ms。

1.3.8 表观形态观察

1.3.8.1 扫描电子显微镜观察

参考Xiao Zhigang等[22]的方法，将干燥样品进行固定喷金后，利用扫描电子显微镜在3 kV条件下对样品放大1 000 倍后的微观结构变化进行观察，并观察颗粒表面形态。

1.3.8.2 激光扫描共聚焦显微镜观察

用激光扫描共聚焦显微镜观察米谷蛋白在复合物样品中的分布情况。利用丙酮配制的0.01 g/mL异硫氰酸荧光素和0.2 g/mL罗丹明B荧光染色剂混合溶液对复合物避光染色10 min，并在去离子水冲洗后盖上盖玻片以便进行观察拍照。扫描条件：激发波长为561 nm，绿色激光束激发，放大100 倍采集图像。

1.3.9 流变特性的测定

参考张亭亭[23]的方法稍加修改，选择直径为40 mm的平板，间距设置为0.2 mm。测试前，将样品与水以1∶20的质量比进行糊化处理，随后冷却至室温并测试。

1.3.9.1 静态流变特性的测定

设定温度为25 ℃，剪切速率在0～300 s-1范围内递增，再在300～0 s-1范围内递减。并采用幂定律模型对静态剪切数据点进行回归拟合，剪切应力的计算如下式所示。

式中：τ为剪切应力/Pa；K为稠度系数/（Pa·sn）；γ为剪切速率/s-1；n为流体指数。

1.3.9.2 动态流变特性的测定

在温度为25 ℃、应变力为0.5%的条件下对样品的动态流变特性进行测试，测试时夹具周围涂一层薄薄的硅油以防止样品中水分蒸发。选择在角频率1～100 rad/s的测试范围内测定样品的储能模量（G’）、损耗模量（G’’）及损耗角正切值tanδ，从而测定样品的黏弹性。

1.4 数据统计与分析

所有样品均重复平行测定，所得结果表示为平均值±标准差，使用PeakFit v4.12、OMNIC 9.2、Origin 2018软件进行数据处理及绘图，采用SPSS 17.0软件对所得数据进行方差分析，以P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 挤压条件及物料比对挤压复合物回生特性的影响

回生值是反映产品老化程度的重要指标，与淀粉的重新排列有着重要关联，回生值越低淀粉越不易老化[24]。由图1A可以看出，随着螺杆转速的提高，挤压复合物的回生值先降低再升高，这可能是因为随着螺杆转速的提高，阻力与扭矩增大，淀粉颗粒有序结构破坏程度加大，回生值降低；而螺杆转速过高会使得物料在挤压机内的停留时间过短，从而导致其加工化程度减弱，无法有效抑制回生。

图1 螺杆转速（A）、挤压温度（B）、物料水分质量分数（C）及物料比（D）对挤压复合物回生特性的影响Fig.1 Effects of screw speed (A),extrusion temperature (B),raw material moisture content (C) and material ratio (D) on the retrogradation characteristics of extruded composite

如图1B所示，温度的升高可以促进水分子的运动及淀粉氢键的断裂，影响淀粉分子的取向重排，从而导致混合体系回生值下降[25]；但是过高的温度会导致复合体系的水分蒸发，不利于回生值的降低。

如图1C所示，物料水分质量分数的增加使物料黏度增大，延长了物料在挤压腔内的停留时间，导致淀粉颗粒破坏程度加大、氢键断裂，从而有效降低了复合物的回生值；而物料水分质量分数过高会增加其润滑性，缩短其在挤压腔内的停留时间，导致抗回生效果变差，这与张艳荣等[26]的研究结果相似。

参照粳米中淀粉与蛋白质含量比例，研究大米淀粉/米谷蛋白物料比在95∶5～87∶13范围内对复合物回生值的影响。如图1D所示，随着米谷蛋白添加量的增加，回生值表现为上升的趋势，但是相较于未挤压的混合物明显降低，这是由于在挤压机内淀粉分子会与引入的米谷蛋白分子通过共价/非共价相互作用发生聚合，从而阻碍直链淀粉分子通过氢键发生重排，导致回生值下降[27]；而过多的米谷蛋白会围绕在淀粉周围形成保护膜，阻碍淀粉分子被挤压破坏，从而导致其抗回生特性减弱。但由于挤压过程中，物料比为91∶9时复合物挤出更为稳定，且回生值并没有明显提高，因此，最终实验选择在螺杆转速为300 r/min、挤压温度为90 ℃、物料水分质量分数为34%、大米淀粉/米谷蛋白物料比为91∶9的条件下制备挤压复合物。

2.2 挤压处理对复合物糊化特性及热力学特性的影响

如图2A所示，未挤压的混合物及大米淀粉表现出典型的RVA曲线，而挤压处理后91∶9复合物（以下简称复合物）的RVA曲线发生明显变化。峰值黏度是淀粉颗粒膨胀和破裂平衡时的黏度，由表1可知，与大米淀粉相比，添加米谷蛋白后，混合物的峰值黏度由（3 452.67±12.10）cP显著降至（3 005.00±25.00）cP（P＜0.05），而经挤压处理后，复合物的峰值黏度显著降低至（429.00±5.00）cP（P＜0.05）。这可能是由于混合物中米谷蛋白与大米淀粉在糊化过程中通过共价作用而相互吸引，抑制了淀粉颗粒的膨胀，从而使峰值黏度下降；而挤压过程中产生的高剪切力导致淀粉颗粒破损，溶胀度减弱，使挤压复合物的糊化过程减短，从而使其峰值黏度下降[12]。崩解值代表淀粉的热稳定性和抗剪切力能力，崩解值越小，淀粉的热稳定性和抗剪切能力越好[28]，与大米淀粉相比，挤压处理后复合物的崩解值显著降低至（213.00±3.00）cP（P＜0.05），说明挤压后复合物体系状态更加稳定。回生值可以直接反映淀粉老化回生程度，相较于大米淀粉（（1 356.33±2.31）cP），混合物回生值显著降低至（164.33±3.51）cP（P＜0.05），而挤压处理后复合物的回生值显著降低至（27.05±0.14）cP（P＜0.05）。这是由于混合体系（未挤压）糊化过程中米谷蛋白扰乱了淀粉分子的重新运动，而挤压处理促进淀粉分子与米谷蛋白的紧密结合，更大程度上阻碍了直链淀粉分子之间的相互作用，从而抑制回生[29]。此外，对样品的热特性进行分析，从图2B及表1中可以发现，大米淀粉与混合物分别在（70.25±1.37）℃与（70.76±2.34）℃处出现吸热峰，而挤压处理后复合物的吸热峰明显消失，这是因为挤压处理使淀粉分子发生变性，淀粉的结晶结构被破坏，双螺旋发生解聚，导致其热焓值降低，从而改变了挤压复合物的热特性，导致其回生特性减弱。本研究结果说明挤压处理及米谷蛋白的参与有利于淀粉抗回生特性的增强，对拓展大米淀粉-米谷蛋白复合体系的应用具有重要意义。

表1 糊化特性及热力学特性参数Table 1 Parameters of pasting and thermodynamic properties

图2 挤压处理对复合物糊化特性（A）及热力学特性（B）的影响Fig.2 Effect of extrusion treatment on pasting properties (A) and thermodynamic properties (B) of the composite

2.3 挤压处理对复合物结晶度的影响

如图3所示，大米淀粉与混合物在15°、17°、18°及23°附近出现4 个明显的衍射峰，具有典型的A晶型峰。挤压处理后，复合物的结晶结构被破坏，原有特征峰消失，与混合物（（20.18±0.13）%）相比，相对结晶度显著降低至（2.17±0.43）%（P＜0.05）（表2），并且在20°附近出现了新的衍射峰，这表明复合物发生了回生现象[21]。淀粉的回生程度与结晶度成正相关，相对结晶度的降低表明复合物的回生特性明显下降，这与糊化特性的测定结果相印证。这是由于挤压条件下，高剪切高热量促进了水分子的迁移及米谷蛋白分子的运动，破坏了淀粉颗粒间原有的氢键，导致双螺旋结构解旋，进而减少淀粉混合体系的有序结构，使其结晶度随之降低，从而有效抑制了复合物的短期回生[30]。

表2 挤压处理对复合物相对结晶度、1 047 cm-1/1 022 cm-1比值和弛豫峰面积占比的影响Table 2 Effect of extrusion treatment on the relative crystallinity,ratio between peak intensities at 1 047 and 1 022 cm-1 and relaxation peak area percentages of the composite

图3 挤压处理对复合物XRD图谱的影响Fig.3 Effect of extrusion treatment on the XRD pattern of the composite

2.4 挤压处理对复合物分子结构及水分分布的影响

由图4 可知，样品的傅里叶变换红外光谱图在3 600～3 100 cm-1范围内有一个强吸收峰，这与羟基伸缩振动有关[31]。与混合物相比，挤压后复合物的羟基伸缩振动峰向低波数移动，从3 289.19 cm-1移动至3 280.16 cm-1，这表明米谷蛋白与大米淀粉之间发生氢键作用，阻碍大米淀粉中直链淀粉间氢键的形成，从而抑制其回生老化[32]。此外，与混合物相比，复合物在1 536 cm-1处产生新的特征峰，归因于C＝O及C＝N振动，这是由于挤压过程中淀粉降解产生的小分子糖与米谷蛋白发生了美拉德反应[33]，以上结果表明米谷蛋白的引入改变了淀粉原有的化学键组成，从而影响了淀粉的空间结构。

图4 挤压处理对复合物傅里叶变换红外光谱（A）和去卷积傅里叶变换红外光谱（B）的影响Fig.4 Effect of extrusion treatment on raw (A) and deconvoluted (B)Fourier transform infrared spectra of the composite

此外，1 022 cm-1与1 047 cm-1处的峰值强度比值（1 022 cm-1/1 047 cm-1比值）可反映淀粉中无定形和有序区域（结晶区）的数量，从而反映淀粉的短程有序结构。未经过挤压处理的混合物与大米淀粉1 047 cm-1/1 022 cm-1比值并没有显著差异（P＞0.05）；与混合物相比，挤压处理后复合物1 047 cm-1/1 022 cm-1比值显著降低至0.43±0.08（P＜0.05）（表2）。由此可见，挤压处理能显著减少大米淀粉/米谷蛋白复合体系中淀粉的短程有序结构，延缓淀粉回生。

本研究通过样品体系的水分分布情况分析其回生特性变化。由图5可知，因水分子迁移率不同，所有样品的弛豫图谱中从左至右均有3 种峰，即T21、T22、T23，分别代表强结合水、弱结合水及自由水。通过对弛豫图谱的积分计算出3 个峰的面积占比，分别表示为A21、A22、A23（表2）。相较于大米淀粉及混合物，复合物的强结合水及弱结合水峰面积占比均降低，且自由水峰面积占比显著增加（P＜0.05）。这表明挤压处理后水分子与淀粉间的氢键作用被破坏，从而使结合水被挤出[21]，并使自由水峰面积占比增加至（94.17±0.08）%。另一方面，挤压处理后，复合物自由水的弛豫时间短于未挤压处理的混合物，T23峰出现时间明显提前，这是由于米谷蛋白与淀粉之间的相互作用形成了新的网络结构，抑制了自由水在复合物中的迁移，从而提高了淀粉复合物对自由水的保水能力，对其长期与短期老化均有抑制作用[13]。

图5 挤压处理对复合物水分分布的影响Fig.5 Effect of extrusion treatment on moisture distribution of the composite

2.5 挤压处理对复合物微观形态的影响

利用扫描电子显微镜及激光扫描共聚焦显微镜对样品的表观形貌及分布状态进行表征。如图6A所示。大米淀粉呈现出边缘形态的小颗粒形状，与米谷蛋白均匀混合后，二者呈现堆叠状态（图6B）。而挤压处理后，复合物颗粒发生明显变化，颗粒直径明显增大，表面更加致密（图6C）。通过激光扫描共聚焦显微镜进一步研究米谷蛋白淀粉网络的分布情况（图6D），发现米谷蛋白被淀粉体系捕捉并束缚其中，使得复合物结构更加均匀紧密，这与扫描电子显微镜观察的结果相印证，证明米谷蛋白可以分散淀粉颗粒并阻碍淀粉分子间发生相互作用，有利于抑制淀粉的回生[21]。

图6 样品扫描电子显微镜和激光扫描共聚焦显微镜图Fig.6 Scanning electron microscopy and LSCM images of different samples

2.6 挤压处理对复合物流变特性的影响

并通过幂定律模型对流变参数进行回归拟合（R2＞0.99），所得参数见表3。如图7A所示，随着剪切速率的增大，挤压前后混合物体系的剪切应力均随之增大；挤压后复合物剪切应力明显下降，表明挤压后复合物的黏性降低，这与糊化特性的测定结果一致。当剪切速率降低时，体系结构不能短时间恢复至原本状态，导致曲线上行与下行不能重合而出现滞后环，滞后环的面积越大则表明体系黏性保持能力越差，从而表明体系内分子颗粒破坏较为严重。从图7A中可以看出，样品下行线的剪切应力均低于上行线，呈现顺时针环状，且复合物的滞后环面积大于混合物，表明挤压后淀粉颗粒破损程度更严重，从而使复合物回生得到延缓，这与XRD、RVA的分析结果相印证。

表3 复合物挤压前后幂定律模型参数Table 3 Power-law model parameters of extruded and non-extruded composite

图7 挤压处理对复合物静态流变曲线（A）、G’（B）、G”（C）及tan δ（D）的影响Fig.7 Effect of extrusion treatment on the static rheological curve (A),G’ (B)、G”(C) and tan δ (D) of the composite

由表3可知，拟合结果的决定系数R2在0.995 1～0.999 9范围内，表明本研究中幂定律对静态流变特征曲线的拟合度较高。K值代表体系的增稠能力，挤压复合体系的K值显著降低（P＜0.05），与其黏度明显下降的结论相印证。流体指数n反映了体系与牛顿流体的接近程度，n＝1时为牛顿流体，较低的n值表明流体具有较高的假塑性[12]。混合物上行线及下行线的n值分别为0.4 6±0.0 2和0.49±0.04，远小于1；而复合物的上行线及下行线n值分别为0.77±0.01和0.99±0.02，接近于1，表明混合体系挤压处理后趋向于牛顿流体特征。

如图7B～D所示，挤压处理改变了混合体系的G’与G”，tanδ为G”与G’的比值，tanδ越大，混合物体系的流动性越强，tanδ越小，体系的固体特性越强[12]。由图7B、C可知，复合物的G’与G”值均低于混合物。低G’值表明挤压处理后复合物的弹性减弱，这是由于挤压破坏了淀粉分子的结构，使其发生破损及降解，产生溶解性小分子多糖，难以发生吸水膨胀反应；另一方面，部分大米淀粉与米谷蛋白分子相互结合与缠绕，阻止直链淀粉间相互结合，从而导致淀粉弹性减弱。低G”值表明挤压复合物的黏性下降，这与RVA分析结果相印证。此外，随着角频率的增加，混合物的tanδ增加，而复合物的tanδ逐渐减小，这表明挤压处理后的复合物固体特性随频率的增加而增强。且混合体系挤压后的tanδ一直高于挤压前，这表明挤压后体系的流动性较强，具有良好的亲水性，可影响淀粉体系与水分子的水和作用，并在米谷蛋白的参与下干扰淀粉分子内部氢键的形成，从而延缓复合物的短期回生，这与Sheng Long等[29]的研究结果一致。

3 结论

本研究以回生值为指标，分析挤压参数及大米淀粉/米谷蛋白物料比对混合体系的影响。结果表明：当挤压螺杆转速为300 r/min、挤压温度为90 ℃、物料水分质量分数为34%、大米淀粉/米谷蛋白物料比为91∶9时，对复合物回生具有较好的抑制效果。此外，通过XRD、低场核磁共振和流变特性等多种表征手段分析发现，挤压处理可以破坏淀粉分子结构，使其颗粒破损，并在米谷蛋白及水分子的作用下阻碍淀粉分子有序重排，减少直链淀粉间的氢键作用，从而导致复合物的峰值黏度、终值黏度、崩解值及回生值显著降低（P＜0.05），相对结晶度下降，1 047 cm-1/1 022 cm-1比值降低，形成更加均匀紧密的微观结构，并使体系内结合水峰面积占比降低，对自由水的持水能力增强，从而使复合物表现出较好的抗回生性。同时，挤压处理后复合物的剪切应力、G’及G’’降低，黏弹性下降，说明挤压处理对复合物的短期回生具有较好的延缓作用。综上，挤压处理可以有效增强大米淀粉/米谷蛋白互混体系的抗回生特性，本研究结果为淀粉蛋白混合体系在食品中的开发应用提供了新的方向及理论依据。