基于电子鼻和GC-IMS技术对涨袋生抽的风味分析

刘仕洋，孔祥聪，付彩霞，席 啦，郭 壮，2，王玉荣*

（1.湖北文理学院 湖北省食品配料工程技术研究中心，湖北 襄阳 441053；2.湖北土老憨生态农业科技股份有限公司，湖北 宜都 443302；3.湖北省发酵调味品工程技术研究中心，湖北 宜昌 443302）

生抽是中国传统的发酵调味品，以大豆、小麦和食盐等为主要原料，经微生物发酵酿造制成[1]。FENG Y Z等[2]的研究表明生抽中含有多达300种挥发性物质，且这些化合物对酱油的感官品质较为重要。WANG S等[3]分析了日本酱油中挥发性化合物的种类，并评价酱油的感官等级，发现在解析出的64种挥发性化合物中，丙酮酸乙酯和3-羟基-2-丁酮等19种化合物与酱油感官品质呈正相关，而4-乙基-2甲氧基苯酚和吡嗪等25种化合物的含量与酱油感官质量呈负相关。由此可见，生抽的感官品质与其蕴含挥发性化合物的种类与含量密切相关。

市售酱油在货架期内偶尔会出现涨袋、胖听或涨瓶的现象，其颜色会变深且pH值会升高[4]，引起生抽涨袋的原因主要包括微生物产气的生物原因、热胀冷缩的物理原因和酸碱反应的化学原因[5]，蒋雪薇等[6]研究发现，涨袋的酱油风味会变寡变劣，徐一奇[7]研究表明变质酱油中酱香成分明显减少，出现明显的酸馊味，其与酱油中总酸及双乙酰含量的升高有一定关系。电子鼻技术具有操作便捷、准确度高和检测周期短等优点[8]，气相色谱-离子迁移谱（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）技术具有灵敏度高、分析速度快和操作简单等优点[9]。相较于气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技术，GC-IMS无需对样品进行处理且其具有更强的分离能力[10]。目前，关于涨袋生抽的研究主要集中在解析其变质微生物的组成上[6]，而对于涨袋和正常生抽中风味物质比较分析的研究相对较少。由此可见，使用电子鼻和GC-IMS联用技术比较分析涨袋和正常生抽中的挥发性风味物质具有较强的可行性。

某生抽生产厂家生产的两个批次生抽在储藏过程中出现了涨袋现象，本研究采集了2个涨袋生抽样品，并以正常的生抽样品作为对照，使用电子鼻和GC-IMS联用技术对两者挥发性风味物质的差异进行了比较分析，以期为生抽涨袋问题的解决提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

于2022年7月和8月，从某生抽生产厂家采集生抽样品3份，其中2份样品在储藏过程中出现了涨袋现象，编号为J1和J2，同时采集正常生抽样品1份，编号为CK，所有样品的生产时间均为2022年5月。

1.2 仪器与设备

PEN3电子鼻：德国Airsense公司；FlavourSpecR气相色谱-离子迁移谱联用仪：德国G.A.S.公司。

1.3 实验方法

1.3.1 电子鼻对生抽的风味评价

参照SHI J等[11]的方法，并稍作修改，取15 mL待测生抽于样品瓶中，在室温下静置2 h后，使用电子鼻探头进行检测，在60 s的测试时间中取已达平衡的49 s、50 s和51 s时测试数据的平均值作为检测数据，取平均值，每个样品平行检测3次。

1.3.2 GC-IMS对生抽中挥发性化合物的解析

取1 mL样品置于20 mL顶空瓶中，40 ℃平衡15 min后自动顶空进样，顶空进样条件设置如下：进样体积为200 μL，进样针温度为85 ℃，孵化转速为500 r/min。GC和IMS条件均参照张振东等[12]的方法，最后通过美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）和信息管理系统（information management system，IMS）数据库对挥发性化合物进行定性分析，通过峰面积归一化法确定各物质的相对含量。

1.3.3 相对气味活度值计算

相对气味活度值（relative odor activity value，ROAV）是评价样品中各种挥发性化合物对于总体风味的贡献[13]，其中0.1≤ROAV≤1的化合物对于样品的总体风味有重要的贡献，ROAV≥1的化合物是关键风味化合物，ROAV的计算公式如下：

其中：Ci代表各挥发性化合物的相对含量，%；Ti代表各挥发性化合物相应的感觉阈值，μg/L，Cmax代表对样品总体风味贡献最大的挥发性化合物的相对含量，%；Tmax代表对样品总体风味贡献最大的挥发性化合物相应的感觉阈值，μg/L。

1.3.4 数据处理

使用方差分析对不同样品间的差异性进行分析；使用Origin 2018软件绘制挥发性化合物的柱状图；使用SIMCA 14.1.0软件进行偏最小二乘-判别分析（partial least squaresdiscriminant analysis，PLS-DA）建模。

2 结果与分析

2.1 基于电子鼻技术涨袋和正常生抽挥发性风味品质的比较分析

本研究首先使用电子鼻对涨袋和正常生抽风味品质进行了评价，PEN3电子鼻具有10个不同的金属氧化物传感器，但其中W1S、W2S、W5S和W6S传感器分别对甲烷、乙醇、氮氧化物和氢气敏感，故而本研究仅用剩余6个传感器对涨袋和正常生抽响应值的差异性进行了分析，结果见表1。

表1 电子鼻各传感器对涨袋和正常生抽响应值的比较分析Table 1 Comparative analysis of the response values of each sensor of electronic nose for the light soy sauce in expanded bag and normal bag

由表1可知，传感器W1C、W3C和W5C对涨袋生抽的响应值显著偏低（P＜0.05），而传感器W1W、W2W和W3S对涨袋生抽的响应值显著偏高（P＜0.05）。结合各传感器的性能发现，生抽涨袋后芳香类物质的含量明显降低，而有机硫化物、萜类物质和烷烃类物质的含量明显升高。

2.2 基于GC-IMS技术涨袋和正常生抽中挥发性化合物的比较分析

为了解析涨袋和正常生抽样品的风味差异，本研究使用GC-IMS技术对其挥发性化合物的组成进行了比较分析，同时使用Reporter插件构建了差异谱图，正常生抽样品的二维俯视图以蓝色为背景，其中漂移时间为1.0 ms处的红色竖线代表反应离子峰（reactive ion peak，RIP），RIP峰两侧的点均代表生抽样品中存在的挥发性化合物，红色越深，点越大，代表该化合物的浓度越高，相反，白色点越深越大，代表对应物质的浓度越低。为更清晰地比较涨袋和正常生抽样品中挥发性化合物的差异，本研究将正常生抽的二维谱图作为参比，用涨袋生抽样谱图减去参比，而后2个涨袋生抽样品的差异谱图以白色为背景，其中红色代表该有化合物在涨袋生抽中浓度更高，蓝色代表该化合物在正常生抽中浓度更高，结果见图1。

图1 涨袋和正常生抽挥发性化合物的差异谱图Fig.1 Differential spectra of volatile compounds in the light soy sauce in expanded bag and normal bag

由图1可知，生抽样品中的挥发性组分在1 600 s内完成分离，离子迁移时间处于0.10～1.75 ms之间，涨袋和正常生抽样品的差异谱图中红色点的大小和分布均存在较为明显的差异，故而可以推测生抽涨袋后挥发性化合物的组成和含量具有不同程度的变化。

为了进一步解析生抽的挥发性风味物质，本研究对涨袋和正常生抽样品中的挥发性化合物进行定性定量分析，发现鉴定出的30种化合物在所有样品中均存在，共7类挥发性化合物，分别为醇类、酮类、酯类、酸类、醛类、含硫类和呋喃类物质。统计不同样品中各类挥发性化合物的相对含量，结果见图2。

图2 涨袋和正常生抽挥发性化合物类别的相对含量比较Fig.2 Comparison of the relative contents of volatile compound classes in the light soy sauce in expanded bag and normal bag

由图2可知，醇类、酮类、酯类、酸类、醛类、含硫类和呋喃类物质在涨袋生抽中累计平均相对含量分别为56.78%、13.21%、8.96%、6.23%、2.93%、0.52%和0.21%，在正常生抽中平均相对含量分别为55.72%、15.66%、7.43%、6.91%、5.25%、0.15%和0.07%。经方差分析发现，涨袋和正常生抽样品中上述物质的累计平均含量差异均不显著（P＞0.05）。杨晓璇等[14]同样采用GC-IMS技术从散装和品牌酱油中共检测出72种挥发性组分，其中含量最高的分别是醛类、醇类、酮类和酯类，这与本研究结果类似，但其亦解析出本研究中未发现的醚类化合物，造成这种现象的原因可能是原料品质、生产地区和制作方式等存在一定差异。

醛类物质是酱油中产生麦芽和坚果香味的主要成分，可在醇脱氢酶的作用下由醇转化而成，或淀粉类物质在酶解后生成的葡萄糖经醛酸途径产生[15]，其在涨袋和正常生抽样品中平均相对含量分别为2.93%和5.25%，可见正常生抽可能具有较好的麦芽香和坚果香气。酯类物质产生了酱油的基本香气成分，可通过醇和酸的酯化形成，或通过以高级醇和乙酰辅酶A为底物经醇乙酰转移酶的生物合成产生[16]，其在涨袋和正常生抽样品中累计平均相对含量分别为8.96%和7.43%。酮类物质是酱油中产生麦芽香味的主要成分，可以通过脂质氧化或Strecker反应诱导氨基酸降解产生[17]，其在涨袋和正常生抽样品中累计平均相对含量分别为13.21%和15.66%，可见正常生抽可能具有较好的麦芽香气。二甲基硫是本研究中唯一被解析出的含硫化合物，其在涨袋和正常生抽样品中平均相对含量分别为0.52%和0.15%，邓岳等[18]使用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用方法发现传统工艺酿造酱油中亦含有该物质，虽然在酱油中含量仅为3%，但对风味品质形成的影响较大。作为呋喃环系最重要的衍生物，糠醛是本研究从生抽中检测出的唯一呋喃类物质，其在涨袋和正常生抽样品中平均相对含量分别为0.21%和0.07%，MENG Q等[19]研究表明，糠醛具有较高的挥发性，是戊糖通过美拉德反应的主要脱水产物，在制曲时对大豆和小麦的热处理过程中形成。综上所述，在涨袋生抽中醇类、酯类、二甲基硫和糠醛的累计含量更高可能是引起其味道刺鼻的主要原因，而正常生抽风味相对温和且具有较好的麦芽和坚果香气。

2.3 涨袋和正常生抽中关键挥发性成分的比较分析

由于样品中挥发性化合物的相对含量与其总体风味特征之间无直接的关系，故而本研究使用相对气味活度值（ROAV）对涨袋和正常生抽的总体风味物质进行了分析，在解析出的30种挥发性化合物中异戊醇和丁醇等11种化合物具有单体和二聚体两种形态，本研究将一个物质中单体和二聚体相对含量总和记为该物质的相对含量值，并进一步计算了各化合物在涨袋和正常生抽样品中的ROAV值，ROAV＞0.1的挥发性化合物测定结果见表2。

表2 涨袋和正常生抽样品中ROAV＞0.1的挥发性化合物Table 2 Volatile compounds in the light soy sauce in expanded bag and normal bag (ROAV＞0.1)

由表2可知，乙酸乙酯在生抽中的阈值为5.00 μg/L，且其在涨袋生抽J2样品中的相对含量最高，对生抽整体的风味贡献较大，因此本研究将J2样品中乙酸乙酯的ROAV定义为100，从而得到生抽中所有解析出化合物的ROAV。经统计发现，在3个样品中共存在16种对生抽总体风味具有较为重要贡献的风味化合物，包括4种醇类、5种酯类、3种醛类、3种酮类和1种含硫类。通常认为0.1≤ROAV＜1的物质是修饰样品整体风味的化合物，ROAV＞1的物质是样品中的关键风味化合物，且ROAV越大代表该化合物在样品的风味品质中贡献越大[29]。因此，根据方差分析结果，在本研究解析出的10种关键风味化合物（ROAV＞1）中，异戊醇、乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸-2-甲基丁酯、3-羟基-2-丁酮和二甲基硫6种化合物在涨袋生抽中含量显著高于正常样品（P＜0.05），可能是这些化合物的共同作用从而引起涨袋生抽的刺激性气味；乙酸甲酯、2-甲基丁醛和丙酮等3种化合物在正常生抽中含量显著高于涨袋样品（P＜0.05），而2-甲基丙醛仅在J2涨袋生抽样品中含量显著高于正常样品（P＜0.05），J1中显著低于正常样品（P＜0.05），故而无法明确生抽涨袋变质对于2-甲基丙醛含量的影响。

2.4 涨袋和正常生抽中差异挥发性化合物分析

为了进一步解析涨袋和正常生抽中具有显著差异的挥发性化合物，本研究使用PLS-DA对解析出的30种化合物进行了投影变量重要性（variable important in projection，VIP）分析，并绘制了差异挥发性化合物的热图，结果见图3。

图3 涨袋和正常生抽中差异挥发性化合物偏最小二乘回归分析热图Fig.3 Heat map of partial least squares discriminant analysis of differential volatile compounds in expanded and normal light soy sauce

由图3可知，涨袋和正常生抽中共存在11种差异挥发性化合物，包括异戊醇、3-羟基-2-丁酮、丙酮、乙酸乙酯、2-丁醇、乙醇、1-丙醇、异丁醇、2-丁酮、苯甲醛和乙酸，其VIP值分别为2.04、2.00、1.62、1.53、1.42、1.35、1.33、1.33、1.18、1.14和1.08。相较于正常生抽，涨袋生抽中异丁醇、1-丙醇、3-羟基-2-丁酮、异戊醇、乙酸乙酯和2-丁醇的含量相对偏高，而乙醇、丙酮、2-丁酮、苯甲醛和乙酸的含量相对偏低，故而可推测涨袋生抽风味品质变差可能与这些化合物含量的变化有关。

为了分析生抽样品中差异挥发性化合物与其风味品质的相关性，本研究结合电子鼻数据绘制热图，结果见图4。由图4可知，丙酮和苯甲醛含量与W2W（对有机硫化物灵敏）和W3S（对烷烃灵敏）均呈显著负相关（P＜0.05），2-丁酮含量与W1C（对芳香类物质灵敏）和W5C（对烷烃、芳香类物质灵敏）均呈显著正相关（P＜0.05），与W3C（对氨气、芳香类物质灵敏）呈极显著正相关（P＜0.001），与W1W（对有机硫化物、萜类物质灵敏）呈显著负相关（P＜0.05）。综上所述，涨袋后生抽中腐败微生物可能对丙酮、2-丁酮和苯甲醛等风味化合物进行了利用，这可能是引起涨袋生抽中芳香类物质的含量明显降低，而有机硫化物、萜类物质和烷烃类物质的含量明显升高的一个重要原因。

3 结论

本研究采用电子鼻和GC-IMS技术对涨袋生抽样品的风味进行了解析，电子鼻结果显示，生抽涨袋后其风味品质明显变差，主要表现出芳香类物质含量降低及机硫化物、萜类物质和烷烃类物质含量的增加，而GC-IMS结果显示生抽涨袋后异丁醇、1-丙醇、3-羟基-2-丁酮、异戊醇、乙酸乙酯和2-丁醇的含量相对增高，而乙醇、丙酮、2-丁酮、苯甲醛和乙酸的含量相对降低，相关性分析显示，引起涨袋生抽风味品质变劣的主要原因可能与丙酮、苯甲醛和2-丁酮含量的降低相关。