基于广泛靶向代谢组学技术分析陈化7 至11 年广陈皮化学成分的差异

陈云丽，颜仁梁，卢雪花，李丽莎，张亚敏，徐小妹，徐榕青，林文津,*

（1.福建省医学科学研究院，福建省医学测试重点实验室，福建福州 350001；2.广东食品药品职业学院，广东广州 510000）

陈皮为芸香科柑橘属小乔木植物橘（Citrus reticulateBlanco）及其栽培变种的成熟果皮，最早记载于《神农本草经》，是药食同源类物质[1]，具有理气健脾、燥湿化痰的功效[2]。2020 年版《中国药典》收载陈皮和广陈皮2 个药材品种，其中，广陈皮来源于橘的变种茶枝柑（Pericarpium Citri Reticulatae'Chachi'），广东新会茶枝柑皮为广陈皮的上品[3]。现代研究表明，陈皮挥发油能温和刺激胃肠道平滑肌，促进消化液分泌，排除肠道积气，增加食欲[4]；陈皮中的黄酮和多糖化合物能清除自由基，具有抗氧化活性[5-6]，抗衰老；陈皮含有的维生素C 能降低胆固醇、预防血管破裂或渗血，和维生素P 服用，治疗坏血病，经常饮用橘皮茶，对动脉粥样硬化或维生素C缺乏者有益[7]；橙皮苷能降低胆固醇，调节肠胃功能和抗血栓形成[4]。陈皮还具有抗肿瘤[8-9]、降血脂[10]、抗肝损伤[11]等多种药理作用，在临床上广泛用于治疗恶心呕吐、咳嗽、消化不良、贫血和呼吸道炎症综合征等[12-13]。陈皮主要含黄酮类[14]、挥发油类[13]、生物碱类[15]、多糖类[16]等成分，对陈皮化学成分的研究主要集中于对不同储存年限、不同产地黄酮[2,17-18]和挥发油成分[19-21]的分析。

《日用本草》云“陈皮多年者更妙”，陈皮久置时间不同，其成分和药理活性存有一定差别[22]，对其变化趋势，不同学者研究不一。目前对于陈皮年份的鉴别常通过拉曼光谱[23]、性状鉴别[24]、近红外光谱[25-26]或测定其成分组成与含量[27-28]。采用性状鉴别，操作简单快速，但具有主观性，准确率低。近红外光谱和光谱学是一种快速、无损、绿色的年份鉴别方法，但需要多种预处理方法优化光谱，消除仪器或样品的干扰，且为单点检测，不能直观观察整个样本，对样本本质的评估会有偏差[29]。通过化学方法判别，能检测到的成分种类少，不能完全体现陈皮陈化过程中所有化学成分的变化。这些方法也不能阐述陈皮的陈化机制，代谢组学可以全面地对生物系统中小分子代谢物进行定性和定量研究，为一种发现生物过程活性驱动因素的技术，适合研究和分析传统中药，突显中药的药理生物活性和生化机制[30-32]。广泛靶向代谢组学技术通过多反应监测技术采集大量的数据并建立代谢物标本数据库实现对代谢物高通量、准确的定性定量[31]，能深入阐述样本的生物活性过程及陈化机制。

颜仁梁等[33]利用UPLC-MS/MS 结合广泛靶向代谢组学对陈化1 年、3 年和5 年广陈皮化学成分的差异进行研究发现，在五年的陈化过程中，随着陈化时间的增加，广陈皮化学成分逐渐趋于稳定。随着存储年限再延长，广陈皮成分是否会产生新的差异有待进一步研究。本实验采用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）结合广泛靶向代谢组学对陈化7 年以上3 种不同年限（7 年、9 年、11 年）的广陈皮化学成分进行组分鉴别分析，使用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）等多元统计分析方法对不同陈化年限广陈皮化学成分差异代谢物进行定量分析，并对差异代谢物的代谢通路进行富集分析和拓扑分析，为深入研究广陈皮陈化机制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验所用18 个广陈皮样品 由广东食品药品职业学院颜仁梁副研究员提供；甲醇、乙腈 色谱级，德国CNW Technologies 公司；甲酸 色谱级，德国SIGMA 公司。

ExionLC AD 超高效液相色谱仪 美国Sciex公司；QTrap 6500+高灵敏度质谱仪 美国Sciex 公司；Heraeus Fresco17 离心机 美国Thermo Fisher Scientific 公司；明澈D24 UV 纯水仪 德国Merck Millipore 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 陈皮样品采集 实验所用陈皮样品均采自广东省江门市新会陈皮核心产区，经广东食品药品职业学院梁永枢副研究员鉴定为芸香科植物广陈皮茶枝柑干燥成熟果皮，陈化时间分别为2014 年（7Y）、2012 年（9Y）、和2010 年（11Y）新会陈皮，分为3 组，每组3 个样品，每个样品分装成两份，共18 份，每份各检验一次，并两两对比（11Y VS 9Y，11Y VS 7Y 和9Y VS 7Y），7Y 广陈皮采集地：广东省江门市新会区天马村、梅江、双水南岸；9Y 广陈皮采集地：广东省江门市新会区茶坑村、围垦村、双水南岸；11Y 广陈皮采集地：广东省江门市新会区天马村（2 份样品）、茶坑村。

1.2.2 样品制备 样品处理方法、质谱与色谱条件参考文献报道方法[33-35]。将陈皮样本冷冻干燥后进行研磨（60 Hz，30 s），称取50 mg 的样品，加入700 μL提取液（甲醇水，体积比3:1，-40 ℃ 预冷，含内标2-氯苯丙氨酸），涡旋30 s（35 Hz），匀浆4 min，冰水浴超声（35 Hz，5 min），重复匀浆超声3 次，并在混匀仪上过夜（4 ℃），将样品于4 ℃，12000 r/min 离心15 min，取上清液经0.22 μm 微孔滤膜过滤，并保存于进样瓶中，用于UPLC-MS/MS 分析。

1.2.3 质控样品 质控样本（QC）由18 份陈皮样本提取物混合制备而成，样品制备项下提取得到的陈皮上清液用提取液稀释10 倍，涡旋30 s 后，每个样本稀释液各取20 μL 混合成QC 样本，加入内标2-氯苯丙氨酸，QC 样本内标浓度相同，在仪器分析过程中，每10 个检测分析样本中插入一个质控样本，以监测分析过程的重复性。

1.2.4 分析条件

1.2.4.1 色谱条件 色谱柱：Waters Acquity UPLC HSS T3（1.8 μm，2.1×100 mm）；柱温：40 ℃；进样体积：2 μL；流速：400 μL/min；流动相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：乙腈；梯度洗脱条件：0～0.5 min（保持2% B），0.5～10 min（2% B～50% B），10～11 min（50% B～95% B），11～13 min（保持95% B），13～13.10 min（95% B～2% B），13.1～15 min（保持2%B）；自动进样器温度：4 ℃。

1.2.4.2 质谱条件 检测仪器：SCIEX 6500 QTRAP+三重四极杆质谱仪（IonDrive Turbo VESI 离子源），结合使用电喷雾电离（ESI）正离子和负离子模式进行检测。离子源参数：离子喷雾电压：+5500/-4500 V；气帘气流速：35 psi；离子源温度：400 ℃；GSI 气体流速：60 psi；GSII 气体流速：60 psi；去簇电压：±100 V；以多反应监测 （MRM）模式进行质谱分析。

1.3 数据处理

质谱数据：使用SCIEX Analyst Work Station Software （Version 1.6.3）对所有数据及目标化合物定量分析。 利用MSconventer 软件将质谱原始数据转成TXT 格式，并使用自撰写R 程序包结合自建数据库完成提峰、注释等工作。代谢组数据：先对单个峰基于四分位距对偏离值进行过滤以去除噪音，只保留单组空值不多于50%或所有组中空值不多于50%的峰面积数据；其次对原始数据中的缺失值进行模拟，数值模拟方法为最小值二分之一进行填补；最后对数据进行标准化处理，利用内标进行归一化。将处理好的数据导入SIMCA 软件，进行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）等多元统计分析，然后根据OPLS-DA 模型第一主成分的变量投影重要度（Variable Importance in the Projection，VIP）大于1 且t检验（t-test）的P值（P-value）小于0.05，进行差异性代谢物筛选。利用KEGG 等数据库对差异代谢物的代谢途径进行富集分析和拓扑分析，找到与代谢物差异相关性最高的关键通路。

2 结果与分析

2.1 不同年限广陈皮代谢组学的分析

使用UPLC-MS/MS 对混样质控QC 样品进行检测，对两次QC 样本总离子流（TIC）出峰保留时间和峰面积进行重叠分析，判断代谢物提取和检测的重复性，为数据的质量提供保障[36]。QC 样本的总离子流图如图1 所示，QC 样本TIC 保留时间和峰面积重叠很好，表明仪器稳定性好，数据可靠。

图1 QC 样本质谱检测TIC 重叠图Fig.1 TIC overlap diagram of QC sample mass spectrometry detection

对7 年、9 年和11 年广陈皮代谢物进行质谱定性定量分析，从18 个实验样本及QC 样本中提取出779 个峰（Peak），经预处理（见1.3 数据处理）后778 个峰被保留，代谢物高分辨二级质谱数据与公共数据库进行比对，利用质谱定性分析匹配得到物质名称，鉴定出27 类778 种化合物，分别属于黄酮类、植物激素类、氨基酸及其衍生物、萜类、生物碱类、其他类等27 类化合物，其他类包括苯甲醛类、苯甲酸衍生物、吡咯烷类、二恶烷类、胍类、甲亚胺酸及其衍生物、芪类等，其中黄酮类和萜类化合物较多，如表1 所示。在 7 年、9 年和 11 年广陈皮均检出 778种化合物。

表1 不同年限广陈皮中代谢物分类及峰面积占比Table 1 Metabolites classification and proportion of peak area of Pericarpium Citri Reticulatae 'Chachi' under different aging years

2.2 不同年限广陈皮代谢组学差异分析

主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）是一种无监督模型，可以揭示数据的内部结构，更好地解释数据变量[37]，三组陈皮代谢组数据经标准化处理后进行PCA 分析，结果见图2 所示，第一主成分（PC1）的贡献率为51.8%，第二主成分（PC2）的贡献率为26.2%，R2X＝0.544，样本全部处于95%置信区间内，三组广陈皮样本并没有区分开，有部分数据靠近，可能是由于品种相同、代谢物种类相近的原因造成。由于PCA 是无监督分类模型，数据会受许多与分组信息无关的变量影响，因此，进行了有监督分类模型OPLS-DA。

采用正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）统计方法，可以过滤掉代谢物中与分类变量不相关的正交变量，并对非正交变量和正交变量分别分析，从而获取更加可靠的代谢物组间差异与实验组的相关程度信息[38]。OPLS-DA 结果如图3 和表2 所示，从结果可以看出，样本全部处于95%置信区间内，Q2值大于等于0.4，说明OPLS-DA 预测性可接受，各两组样本分布于左右侧置信区间内，样本点间没有重叠，区分效果较好。样本点之间分布相对分散，这可能与采样地点不同有关，由OPLS-DA 结果可以看出，陈化时间、产地对广陈皮的代谢有一定的影响。

表2 OPLS-DA 模型参数和置换检验Table 2 OPLS-DA model parameters and permutation tests

图3 广陈皮OPLS-DA 模型的得分散点图Fig.3 Score scatter plot of OPLS-DA model for Pericarpium Citri Reticulatae 'Chachi'

OPLS-DA 置换检验随机模型（次数n=200）如表2 所示，其模型Q2值均小于原模型的Q2值；Q2的回归线与纵轴的截距小于零；同时随着置换保留度逐渐降低，置换Y 变量比例增大，随机模型的Q2逐渐下降。说明原模型具良好的稳健性，不存在过拟合现象，即OPLS-DA 得分图结果准确。

2.3 不同年限广陈皮之间差异代谢分析

2.3.1 不同年限广陈皮差异代谢物鉴定与分析 利用t检验（t-test）的P值（P-value）和 OPLS-DA 模型第一主成分的变量投影重要度（Variable Importance in the Projection，VIP）筛选各组间的差异代谢物，VIP 值可以衡量各代谢物组分含量对样本分类判别的影响强度和解释能力，辅助标志代谢物的筛选[33]。当代谢物同时满足P<0.05 和VIP>1 这两个条件时，则认为存有差异。其中11Y VS 9Y 共筛选出22 类65 种差异代谢物，如表3 所示，占比较多的是黄酮、萜类、生物碱和酚类，有38 种差异代谢物上调和27 种差异代谢物下调，上调物质多为黄酮、氨基酸及其衍生物和核苷酸及其衍生物类物质，下调物质多为生物碱和萜类，其中下调物质萜类为单萜和倍半萜，是挥发油的主要成分，具有挥发性。9Y VS 7Y 筛选到14 类32 种差异代谢物，占比较多的是萜类、黄酮、氨基酸及其衍生物、酚类和生物碱，19 个差异代谢物上调和13 个差异代谢物下调，上调物质多为黄酮和酚类，下调物质多为萜类，为环烯醚萜和三萜类物质。其中高丽槐素、别隐品碱、育亨酸一水化合物、乙酸龙脑酯和Altholactone 在9Y VS 7Y 组中上调，在11Y VS 9Y 下调；N,N-二甲基苯胺、3,4,5,6-四氢吡啶-2-羧酸和Ipecoside 变化与之相反。11Y VS 7Y 筛选到20 类62 种差异代谢物，占比较多的是黄酮、萜类、氨基酸及其衍生物、苯丙素类和酚类，47 种差异代谢物上调和15 种差异代谢物下调，上调物质多为黄酮、氨基酸及其衍生物、苯丙素类和酚类，下调物质多为萜类，且多为三萜类物质。但高丽槐素、别隐品碱、育亨酸一水化合物、乙酸龙脑酯、Altholactone、N,N-二甲基苯胺、3,4,5,6-四氢吡啶-2-羧酸和Ipecoside 这些化合物在11Y VS 7Y 中为非显著差异代谢物。3-羟基-3-甲基谷氨酸、锦葵色素3-O-葡糖苷、乳菇紫素、杜克苷A、右美托咪定、吴茱萸苦素和奇霉素在11Y VS 7Y、9Y VS 7Y 组上调，茉莉酸变化与之相反，但这些化合物在11Y VS 9Y 中为非显著差异代谢物。

表3 不同年限广陈皮差异代谢物Table 3 Differential metabolites of Pericarpium Citri Reticulatae 'Chachi' under different aging years

2.3.2 不同年限广陈皮主要代谢成分比较分析 广陈皮陈化7～11 年过程中，共发现778 种化学成分、121 种差异代谢物，差异代谢物占比约16%，而有约84%的成分保持稳定，不同陈化年限广陈皮代谢物有较大差异，11Y VS 9Y 和11Y VS 7Y 组筛选得到的差异代谢物种类和数量比9Y VS 7Y 多，在7～11 年这过程中，随着陈化时间的增加，广陈皮差异代谢物的数量和种类趋于增多，陈化时间对黄酮类、萜类、氨基酸及其衍生物影响较大。

将各两组对比筛选得到的差异代谢物结果以韦恩图（Venn Plot）的方式进行展示，用于发现多组间差异代谢物，如图4 所示。三组共同交集差异代谢物成分仅为1-Methyladenine（1-甲基腺嘌呤，核苷酸及其衍生物）和L-Methionine（L-蛋氨酸，氨基酸及其衍生物），而1-甲基腺嘌呤和L-蛋氨酸在9Y VS 7Y 组中表现下调，在11Y VS 9Y 和11Y VS 7Y 组上调，各比较组间差异代谢物相差较大。

图4 不同陈化年限广陈皮差异代谢物比较韦恩图Fig.4 Venn plot for differential metabolites comparison of Pericarpium Citri Reticulatae 'Chachi' under different aging years

2.3.3 不同年限广陈皮差异代谢物通路分析 利用KEGG、HDMB 和PubChem 数据库对差异代谢物的代谢途径进行富集分析和拓扑分析，找到与代谢物差异相关性最高的关键代谢通路，通过分析发现：11Y VS 9Y 有14 种差异代谢物富集在15 条通路中，9Y VS 7Y 有7 种差异代谢物富集14 条通路中，11Y VS 7Y 有12 种差异代谢物富集17 条通路中，代谢通路分析的结果以气泡图展示，如图5 所示。有5 条通路是11Y VS 9Y、9Y VS 7Y 和11Y VS 7Y 所共有，分别是：Valine, leucine and isoleucine biosynthesis（缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成）、Cysteine and methionine metabolism（半胱氨酸和蛋氨酸代谢）、Aminoacyl-tRNA biosynthesis（氨酰tRNA 生物合成）、Glucosinolate biosynthesis（葡萄糖苷酸生物合成）和Purine metabolism（嘌呤代谢）。这些差异代谢物参与的代谢途径可能与广陈皮陈化机制有关。

图5 广陈皮代谢通路气泡图Fig.5 Path bubble chart for Pericarpium Citri Reticulatae'Chachi' metabolomics

由图5 综合可知，Monoterpenoid biosynthesis（单萜类生物合成）处的气泡颜色最深，而且最大，说明该通路对11 年和9 年广陈皮之间的差异影响最大，11Y VS 9Y 中萜类成分为单萜和倍半萜；其次是黄酮类物质参与的代谢通路（黄酮和黄酮醇生物合成）、氨基酸及其衍生物参与的代谢通路（丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢）代谢通路对不同年限广陈皮陈化的影响较大，总之，陈化时间对黄酮类、萜类、氨基酸及其衍生物影响较大，随着陈皮储藏年限延长，三类化合物种类和数目也增多。

另外，筛选出的121 种差异代谢物中有34 个化合物能被注释到KEGG 数据库现有的通路，主要包括17 类34 个差异代谢物，富集在45 条通路中，6 种黄酮（包括类黄酮）、6 种氨基酸及其衍生物、4 种单萜、1 种核苷酸及其衍生物、1 种糖类、1 种脂肪酰类、2 种苯丙素类、2 种酚类、1 种芳香类化合物、1 种其他类、3 种生物碱、1 种植物激素、2 种有机氧化合物、1 种羧酸类及其衍生物、1 种醇类和多元醇及1 种有机氮化合物。差异代谢物被注释最多的是黄酮和氨基酸及其衍生物这2 种类别，其中黄酮类物质主要参与黄酮和黄酮醇生物合成、类黄酮生物合成、次级代谢产物的生物合成等多条代谢通路；氨基酸及其衍生物主要参与缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、嘌呤代谢、氨酰tRNA 生物合成、次级代谢产物的生物合成等多条代谢通路。聚类分析结果以热图表示，如图6 所示，不同陈化年限广陈皮代谢物有较大差异，同型丝氨酸（Log2 FC:0.89）、槲皮素（Log2 FC:0.96）、矢车菊素（Log2 FC:1.05）、景天庚酮糖（Log2 FC:0.82）、L-苏氨酸（Log2 FC:0.89）、麦芽三糖（Log2 FC:1.26）、N-甲酰蛋氨酸（Log2 FC:2.18）等成分在11Y VS 9Y 中上调；胸苷（Log2 FC:1.17）、鞘氨醇（Log2 FC:1.41）、D-果糖-6-磷酸（Log2 FC:0.82）、别隐品碱（Log2 FC:0.81）、高丽槐素（Log2 FC:1.62）等成分在9Y VS 7Y 中上调；苯乙酰甘氨酸（Log2 FC:1.54）、N-甲酰蛋氨酸（Log2 FC:1.15）、L-苏氨酸（Log2 FC:0.78）、L-蛋氨酸（Log2 FC:1.04）、同型丝氨酸（Log2 FC:0.78）、黄颜木素（Log2 FC:0.61）、姜黄素（Log2 FC:0.91）、松柏苷（Log2 FC:1.95）、顺式玉米素（Log2 FC:1.95）、金合欢素（Log2 FC:1.40）、6-氨基-2-氧代己酸（Log2 FC:0.4）等成分在11Y VS 7Y 中上调。

图6 广陈皮差异代谢物热图Fig.6 Heat map of differential metabolites for Pericarpium Citri Reticulatae 'Chachi'

3 讨论与结论

本研究运用超高效液相色谱-串联质谱广泛靶向代谢组学技术对7 年、9 年、11 年广陈皮化学成分进行组分鉴别分析，共鉴定出27 类778 个化合物，主要为黄酮类（121 个）和萜类（90 个）等成分，高于利用顶空固相微萃取-全二维气相色谱-飞行时间质谱结合化学计量学方法检测到的约500 种广陈皮化合物[39]，778 个化合物中共筛选出121 种差异代谢物，说明7 年到11 年陈化过程中，约84%的成分保持稳定，约16%是差异代谢物，差异代谢物中黄酮类、氨基酸及其衍生物和萜类占比较多。与前文研究报道[33]的5 年内广陈皮陈化后化学成分变化情况比较，检出了更多的成分，但7 年后广陈皮化学成分变化较小，差异代谢物比例下降，主要是苷类变化较大，可能与苷类成分降解有关，具体机制有待进一步研究。

本实验三组间共同交集差异代谢物成分为1-Methyladenine（1-甲基腺嘌呤，核苷酸及其衍生物）和L-Methionine（L-蛋氨酸，氨基酸及其衍生物），各比较组间相差较大，可能是由于陈化时间或者产地不同等造成的。在本次研究中发现，高丽槐素、别隐品碱、育亨酸一水化合物、乙酸龙脑酯、Altholactone在9Y VS 7Y 组中上调，在11Y VS 9Y 下调；N,N-二甲基苯胺、3,4,5,6-四氢吡啶-2-羧酸和Ipecoside 与之变化相反。但高丽槐素、别隐品碱、育亨酸一水化合物、乙酸龙脑酯、Altholactone、N,N-二甲基苯胺、3,4,5,6-四氢吡啶-2-羧酸和Ipecoside 这些化合物在11Y VS 7Y 中为非显著差异代谢物。3-羟基-3-甲基谷氨酸、锦葵色素3-O-葡糖苷、乳菇紫素、杜克苷A、右美托咪定、吴茱萸苦素和奇霉素在11Y VS 7Y、9Y VS 7Y 组上调，茉莉酸变化与之相反，但这些化合物在11Y VS 9Y 中为非显著差异代谢物。具体原因有待下一步深入研究。

7～11 年广陈皮陈化期间，陈化年限不同的广陈皮代谢物有较大差异，随着陈化时间的增加，广陈皮差异代谢物的数量和种类趋于增多，陈化时间对黄酮类、萜类、氨基酸及其衍生物影响较大。在差异代谢物涉及的代谢通路方面，与代谢物差异相关性最高的关键通路有：单萜类生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成、氨基酸及其衍生物参与的代谢通路（丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢），为陈化机制研究奠定坚实基础。

由于本实验仅对7 年到11 年内的广陈皮样品进行研究，随着存储年限再延长，差异代谢物是否会有新的变化，需要进一步检测研究。但随着陈化时间越长，样本取样难度也越大，特别是收集新会区同一产地不同陈化年限的样本，另外，虽然陈化7～11 年的广陈皮还有较多的差异化学成分，但这些差异化学成分是否对其品质是产生显著影响，需要结合体内外药理实验或临床试验进一步验证。