一测多评法测定醋延胡索中5 种生物碱的含量

秦迎丹，宋 璇，孙 晨，刘 勃，郝玲花，孙玉琦,*

（1.锦州医科大学药学院，辽宁锦州 121001；2.广州粤美医药科技有限公司，广东广州 510700）

延胡索又名元胡，具有悠久的食用和药用历史，其粉末加入红糖水中可缓解腹痛[1]，加入三七大蒜糊中可缓解癌痛[2]。根据“醋注肝经，且资住痛”理论，延胡索醋制后归肝经作用增强，因此多采用其醋制品来发挥镇痛作用[3]。生物碱类化合物是一类重要的天然产物，是（醋）延胡索发挥活性的主要成分[4-5]，主要包括原小檗碱类（叔胺类延胡索甲素、延胡索乙素和季胺类盐酸小檗碱、盐酸巴马汀）、原阿片类（原阿片碱）等生物碱类成分[6]，其中原阿片碱，具有镇痛、抗炎、抗癌等作用[7-8]；延胡索甲素、延胡索乙素同为延胡索行血镇痛的主要活性成分，具有镇痛、镇静、保护胃肠道等作用[9-10]，盐酸巴马汀具有抗炎、抗菌、抗溃疡等作用[11-12]，盐酸小檗碱具有抑菌、降糖、保护神经系统等作用[13-14]。上述5 种生物碱为其发挥活性的主要物质基础[15]，因此将原阿片碱、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、延胡索乙素以及延胡索甲素选为指标成分进行含量测定。

目前对醋延胡索的质量控制中，一般仅针对延胡索乙素，难以全面控制其质量，也有采用色谱法测定醋延胡索中多种生物碱类成分含量的报道[16-17]，但面临指标性成分选择困难，对照品价格昂贵的问题。一测多评法（quantitative analysis of multi-componentsby single marker，QAMS）是利用有效成分间存在的内在函数关系，在相应的线性范围内，在仅测定一个成分（内参物）的基础上，实现对多种成分同步检测的方法[18]，该方法通过建立内参物与待测成分之间的相对校正因子（relative correction factory，RCF），作为计算多种待测成分含量的依据，解决单一指标成分控制质量不够全面，多指标成分控制质量对照品价格昂贵、难以获得全部的问题，已广泛应用于斑花黄堇、钩藤、苦参等含有多种生物碱成分的中药材的质量评价中[19-23]。

虽有采用一测多评法测定延胡索中多种生物碱含量的报道[24-25]，但关于一测多评方法应用于醋延胡索的研究较少。因此本研究采用统一的醋制法对不同产地延胡索按相关标准进行炮制，旨在避免因炮制方法不同而导致的中药材质量差异，随后通过梯度洗脱HPLC 色谱技术，选取价廉易得的延胡索乙素为内参物，拟合延胡索乙素与各生物碱类成分的相对校正因子，通过只测定延胡索乙素的含量，实现对醋延胡索中原阿片碱、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀及延胡索甲素延胡索含量的同步，减少了对照品的使用数量，降低了检测成本，为醋延胡索中生物碱类成分的含量测定提供了新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

延胡索 10 批不同产地样品，信息来源见表1，经鉴定均为罂粟科紫堇属植物延胡索（Corydalis yanhusuoW.T.Wang）的干燥块茎；氨水（分析纯） 天津市科密欧化学试剂有限公司；米醋 广东李锦记食品有限公司；乙腈（色谱纯） 北京Dimka 公司；磷酸（分析纯） 天津市光复精细化工研究所；甲醇（分析纯） 天津大茂化学试剂厂；超纯水；原阿片碱（批号：110853-201805，纯度：99.6%）、延胡索甲素（批号：110720-202019，纯度：99.5%）、盐酸巴马汀（批号：110732-201913，纯度：85.7%）、延胡索乙素（批号：110726-202020，纯度：99.3%）、盐酸小檗碱（批号：110713-202015，纯度：85.9%） 中国食品药品检定研究院。

表1 延胡索样品来源信息Table 1 Source information of Corydalis yanhusuo samples

日立Chromaster 液相色谱仪（配有5410 型检测器、5310 型柱温箱、5210 型自动进样器、5110 二元梯度洗脱泵） 日本HITACHI 公司；VGT-1990QTD型超声波清洗器 苏州江东精密仪器限公司；RE-52A 型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；JJ124BF型天平 上海精胜科学仪器有限公司；YB-2500A 粉碎机 永康式速峰工贸有限公司；DF 型真空干燥箱 上海力辰邦西仪器科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、延胡索乙素、延胡索甲素对照品适量，加甲醇溶解制成浓度为96.00 μg/mL原阿片碱、24.00 μg/mL 盐酸巴马汀、62.50 μg/mL 盐酸小檗碱、120.50 μg/mL 延胡索乙素与100.50 μg/mL延胡索甲素的混合对照品储备溶液。取1 mL 上述混合对照品储备溶液于5 mL 容量瓶中，加甲醇定容，制成含19.20 μg/mL 原阿片碱、4.80 μg/mL 盐酸巴马汀、12.50 μg/mL 盐酸小檗碱、24.10 μg/mL 延胡索乙素与20.10 μg/mL 延胡索甲素的混合对照品溶液。

1.2.2 醋延胡索样品的制备 将10 批延胡索样品，按《中国药典》2020 年版[26]醋灸法炮制：取净延胡索薄片，称重，取20 g 延胡索药材，用4 g 米醋拌匀，置于密闭容器中，加盖闷润，待醋被吸进后，翻炒至表面颜色略为加深，取出、置于真空干燥箱中，干燥后用中药粉碎机粉碎，即得。

1.2.3 供试品溶液的制备 取“1.2.2”项下醋延胡索粉末（过三号筛）0.5 g，精密称定，置于圆底烧瓶中，精密加入浓氨试液-甲醇（1:20）混合溶液50 mL，称重，60 ℃回流提取1 h，冷却，再称重，用浓氨试液-甲醇（1:20）补足减失的重量，摇匀，过滤，精密量取续滤液25 mL，旋转蒸发仪蒸干，加甲醇溶解残渣，并转移到5 mL 量瓶中，加入甲醇定容，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得[27]。

1.2.4 液相色谱条件 Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（三乙胺调至pH6.0，B）；梯度洗脱（0～15 min，22%A；15～35 min，22%～80% A；35～50 min，80% A）；检测波长为280 nm；流速为1.0 mL/min；柱温为30 ℃；进样量为10 μL；理论塔板数按延胡索乙素计不低于3000；分离度>1.5.

1.2.5 QAMS 方法学考察

1.2.5.1 线性关系、检出限和定量限 精密取“1.2.1”项下混合对照品储备溶液，精确取0.25、0.5、1、2、4 mL 的混和对照品溶液液，分别置于5 mL 容量瓶中，加甲醇定容，按“1.2.4”项下色谱条件进样测定，以不同对照品溶液浓度（C）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标进行回归，计算回归方程。取“1.2.1”项下混合对照品溶液，逐级稀释，按“1.2.2”项下色谱条件测定，计算信噪比（S/N），以S/N=3 时对应的待分析物浓度为检出限，S/N=10 时对应的待分析物浓度为定量限。

1.2.5.2 相对校正因子 采用多点校正法[28]，精密取混合对照品溶液，按“1.2.4”项下色谱条件分别进样1、2、5、8、10、20 μL。记录各成分色谱峰峰面积，以延胡索乙素为内参物（S），按下列公式计算各成分的相对校正因子（fi/s）：

式中： fi/s表示相对校正因子；AS表示内参物的峰面积，mAU·min；CS表示内参物的浓度，μg/mL；Ai表示待测成分的峰面积，mAU·min；Ci表示待测成分的浓度，μg/mL。

1.2.5.3 待测组分色谱峰定位 利用相对保留时间法[29]ri/s=ti/ts（ti：待测成分的保留时间，min；ts：内参物的保留时间，min；ri/s为二者的比值即相对保留时间）。对不同仪器和色谱柱、不同体积流量、不同柱温的待测组分色谱峰进行定位；根据保留时间计算公式，已知内参物延胡索乙素的保留时间，根据对原阿片碱、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、延胡索甲素的相对保留时间以及各生物碱的峰型进行定位。

1.2.5.4 精密度、重复性、重复性和平均回收率 精确移取“1.2.1”项下混合对照品溶液1 份，进样测定，连续进样6 次，进行精密度试验；精密称定醋延胡索样品（S1）1 份，按“1.2.3”项下方法制备6 份供试品溶液，进样测定，记录5 种生物碱的峰面积并计算RSD值，进行重复性试验；精密称定醋延胡索样品（S1）1 份，按“1.2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h 进样测定，记录5 种生物碱的峰面积并计算RSD 值，进行稳定性试验；精密称定醋延胡索样品（S1）9 份，每份0.25 g，分别精密加入相当于供试品中待测成分含量的80%、100%、120%的混合对照品溶液，按“1.2.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，进行加样回收率试验。

1.2.5.5 耐用性和系统适用性 精密取混合对照品溶液10 μL，按“1.2.4”项下色谱条件进样，考察不同实验室的两套液相色谱Hitachi Chromaster、Hitachi ELITE LaChrom 系统及三种不同色谱柱Promosil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），不同体积流量（0.8、1.0、1.2 mL/min）、不同柱温（25、30、35 ℃）对相对校正因子的影响。

1.2.6 生物碱含量测定 分别取经炮制的10 批醋延胡索药材，按“1.2.3”项下方法制备供试品溶液、“1.2.4”项下色谱条件进样测定，每份测定三次，分别采用外标法[30]（external standard method，ESM）Cx=Cr×Ax/Ar（Cx 为样品浓度，μg/mL；Cr 为对照浓度，μg/mL；Ax 为样品峰面积，mAU·min；Ar 为对照峰面积，mAU·min）和建立的QAMS 测定醋延胡索样品中原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、延胡索乙素、延胡索甲素5 种生物碱的含量。

1.3 数据处理

利用Microsoft Excel 2019 软件进行数据汇总和分析，应用IBM SPSS Statistics 27.0 软件进行t检验分析。

2 结果与分析

2.1 QAMS 方法学考察结果

2.1.1 线性关系 记录5 种生物碱混合对照品色谱图如图1。以不同对照品溶液浓度（C）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标进行回归分析，结果见表2。结果表明，这5 种生物碱在线性范围内与峰面积线性关系良好，相关系数r>0.9992。以S/N=3 时计算得出检出限为0.036～0.089 μg/mL，S/N=10 时计算得出定量限为0.127～0.314 μg/mL。

图1 5 种生物碱混合对照品溶液HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatographic diagram of five alkaloid mixed reference solutions

表2 对照品的线性关系、检出限与定量限Table 2 Linear relationships, LODs and LOQs of reference substance

2.1.2 相对校正因子 按“1.2.5.2”项下进行试验，以延胡索乙素为内参物，计算原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、延胡索甲素相对校正因子，取相对校正因子的平均值为定量用的fi/s，结果见表3，可知，原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、延胡索甲素相对于延胡索乙素的fi/s分别为1.71、1.91、2.63、0.75，RSD 值<3%。

表3 醋延胡索中4 个成分的相对校正因子Table 3 Relative correction factors of four components in vinegar Corydalis yanhusuo

2.1.3 待测组分色谱峰定位 按“1.2.5.3”项下进行试验，计算原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、延胡索甲素相对于延胡索乙素的相对保留时间ri/s和ri/s的RSD，结果见表4，可知不同仪器与色谱柱、不同体积流量、不同柱温的RSD 值均<3%，对相对保留值影响较小，表明相对保留时间法可用于待测组分色谱峰的定位。

2.1.4 精密度、稳定性、重复性和回收率 按“1.2.5.4”项下进行试验，5 种生物碱的精密度、重复性、稳定性及加样回收率考察结果见表5，精密度、重复性、稳定性RSD 均小于2%，平均回收率在98.38%～101.28%之间，RSD 值均小于2%，表明该方法精密度、重复性、稳定性及回收率良好。

表5 5 种生物碱的精密度、稳定性重复性和回收率Table 5 Precision, stability, repeatability and recovery of five alkaloids

2.1.5 耐用性和系统适用性 按“1.2.5.5”项下进行试验、按“1.2.5.2”项下方法计算原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、延胡索甲素相对于延胡索乙素的校正因子fi/s和fi/s的RSD 值，结果见表6，可知不同仪器与色谱柱、不同流速及柱温对醋延胡索中各生物碱类成分的fi/s的RSD 值均<3%，表明色谱柱、仪器的更换、流速及柱温的微小变化对fi/s无显著影响。

表6 不同因素对相对校正因子的影响Table 6 Effects of different factors on relative correction factors

2.2 生物碱含量测定

按“1.2.6”项下进行试验，记录时色谱图（S1、图2A），分别采用ESM 与建立的QAMS 测定醋延胡索样品中原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、延胡索乙素、延胡索甲素5 种生物碱的含量，10 批样品的HPLC 见图2B，含量测定平均值结果见表7，采用SPSS 软件t检验对含量测定结果进行分析比较，结果原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱和延胡索甲素的ESM 值和QAMS 值两组方法的P>0.05，故原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱和延胡索甲素的ESM 值和QAMS 值间无显著差异（P>0.05），表明建立的QAMS 法准确可行。

图2 醋延胡索样品HPLC 色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of vinegar Corydalis yanhusuo

表7 醋延胡索中5 种生物碱含量测定结果（mg/g）Table 7 Determination results of five alkaloids in vinegar Corydalis yanhusuo (mg/g)

3 结论

本实验建立一测多评法（QAMS）用于测定醋延胡索中5 种生物碱类成分的含量，考察了精密度、重复性、稳定性以及回收率，经考察精密度、重复性及稳定性的RSD 值小于2%，平均回收率98.38%～101.28%之间，均符合要求。同时考察了不同仪器和不同色谱柱、不同体积流量、不同柱温下各成分间的相对校正因子及相对保留时间的变化，RSD 值均小于3%，表明该方法具有良好的适应性且在不同的因素下均能行准确定位。本实验还对ESM 法测得不同产地醋延胡索中的原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、延胡索乙素、延胡索甲素进行含量测定，ESM 含量测定值和QAMS 计算值利用SPSS 软件进行t检验，结果表明2 种方法含量测定的结果经t检验后无显著差异（P>0.05），说明建立的QAMS 法结果准确、方法可行。采用QAMS 法测定醋延胡索中各生物碱成分含量能极大地减少对照品使用数量，节约成本，增加检测便利性，因此该方法可应用于醋延胡索的含量测定，期待为醋延胡索的制剂加工、质量评价与临床应用提供依据。