蔗糖对浒苔多糖凝胶流变特性及结构的影响

张承宗，汤国泯，黄慧琳，周建武，陈 婕，林 岱,*

（1.福建医科大学公共卫生学院，福建福州 350122；2.浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江杭州 310018）

浒苔（Enteromorpha prolifera）是我国东南沿海区域最常见的海洋绿藻之一，具有较高的药食两用价值，历史典籍《本草纲目》及部分沿海城市地方志中均记载了当地居民有食用浒苔的习惯[1-4]。浒苔多糖（E. proliferapolysaccharide，EP）是从浒苔中提取的一种酸性多糖，约占浒苔干重48%～56%[5]，是浒苔中最主要的生物大分子物质。前期研究发现EP 是一类含有硫酸根的多糖[6]，这种硫酸化多糖具有特殊的生物活性，如抗凝血[7]、抗氧化[8]、降血脂[9]、免疫调节[10]、抗炎症[11]、抗肿瘤[12]等。前期研究表明，EP由鼠李糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、岩藻糖、甘露糖和半乳糖组成[13]，其水溶液具有凝胶性，在功能性增稠剂、乳化剂、稳定剂等方向有良好应用潜能。然而，天然来源多糖组分形成的水合凝胶在性质上存在一定局限性，如凝胶强度差、持水能力弱、稳定性差等[14-15]。因此，探索和建立一种性状更加稳定、功能更加丰富的天然多糖复配凝胶体系将有助于浒苔多糖的开发与利用。

蔗糖（Sucrose，SUC）常被用于生产果冻、饮料、糕点等食品，能够增加产品的甜味，改善产品感官和风味[16]。现有研究表明蔗糖不仅改善食物风味，还可以提高多糖凝胶结构稳定性[17]，例如，明胶在加入蔗糖之后，动态黏弹性质及储能模量显著增加[18]，另一研究表明蔗糖可提高明胶的熔化温度[19]，这些性质的改变可以进一步提高明胶的稳定性。此外，糖分子与多糖凝胶原有的羟基结合形成氢键，而蔗糖同时具有较强的疏水作用，这种疏水作用与氢键构成的网状结构极大限制了水分子向外迁移的能力，从而显著提高凝胶持水性[20]。以上研究表明，蔗糖有助于改善多糖凝胶特性，而前期结构表征显示EP 属于硫酸化杂多糖，而目前关于此类多糖凝胶特性及蔗糖对其增效作用的研究尚少。本实验通过添加不同浓度蔗糖建立浒苔多糖-蔗糖（EP-SUC）的复配水合凝胶体系，从流变学、微观结构、化学基团等角度考察复合凝胶的性质与结构，为浒苔在食品领域的产业化应用提供理论基础，为进一步开发和利用海洋绿藻提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

浒苔粉 福建省福清市海兴保健食品有限公司；蔗糖 食品级，福州奥研实验器材有限责任公司；其它所有试剂皆为分析纯。

DK-S24 电热恒温水浴锅 上海精宏设备有限公司；BSA124S 电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；N-1300 旋转蒸发仪 上海爱朗仪有限公司；MCR302 流变仪 Anton Paar；TDZ5-WS 离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；MIX-2500迷你混合仪 杭州佑宁仪器有限公司；LyoQuest-85Plus 真空冷冻干燥机 西班牙Telstar 公司；Thermo Scientific Nicolet iS20 傅立叶变换红外光谱仪 赛默飞世尔科技有限公司；SC7620 溅射镀膜仪 英国Quorum 公司；TESCAN MIRA LMS 扫描电子显微镜 泰思肯（中国）有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的制备 称取60 g 浒苔粉加入到3 L 蒸馏水中，于80 ℃水浴锅中水浴2 h，取上清液后继续加入60 g 浒苔粉水浴2 h，使用纱布将无法溶解的物质过滤。将2 次滤清液置于旋转蒸发仪中，设置温度为80 ℃，蒸发、浓缩1.5 h 得到粗多糖。根据课题组前期研究报道，采用Sevag 法除去多糖中蛋白质后，经过DEAE Sephadex A-25 离子交换色谱及葡聚糖凝胶Sephadex G-100 色谱柱层析对多糖进行纯化[21]，纯化后的溶液置于冷冻干燥获得EP 粉末。最终，样品中含可溶性多糖56.12%。

EP 凝胶的制备：在添加蔗糖之前，需要首先考察不同质量浓度EP 形成凝胶的能力。分别配制10 mL浓度为30、40、50、60、70 mg/mL 的EP 溶液，并将各样品放置80 ℃水浴锅中水浴10 min，振荡30 s，待溶液降至室温25 ℃后备用。

EP-SUC 复配体系的制备：参考蔗糖在加工食品过程中常用添加量[22]，分别配制浓度为0、0.2、0.3、0.4 g/mL 的蔗糖溶液，称取EP 分别加入不同浓度蔗糖溶液中，使样品中EP 的终浓度均为60 mg/mL。将各样品放置在80 ℃水浴锅中水浴10 min，振荡30 s，待溶液降至室温25 ℃后备用。

1.2.2 流变特性的测定 流变特性测试采用安东帕MCR302 流变仪平板-平板测量系统，平板直径25 mm，测量间隙1.000 mm，测试温度25 ℃[14]。

黏度测定：对不同浓度EP 及EP-SUC 样品分别进行旋转模式-剪切速率扫描实验，设定测量温度为25 ℃，观察各EP 溶液黏度η随剪切速率γ变化规律，探究不同SUC 浓度对EP 黏度的影响。

线性黏弹区测定：对添加不同SUC 浓度的EP溶液进行振荡扫描-线性黏弹区测定，设定温度25 ℃，频率10 rad/s，应变扫描范围0.1%～100%，测定G′随应变的变化情况，从而得到各EP 溶液的线性黏弹区，再进行动态黏弹性测定。

动态黏弹性测定：对不同浓度EP-SUC 复合凝胶进行振荡扫描-频率扫描实验，在线性黏弹区间内设定应变，设定角频率为0.1～100 rad/s，设定温度为25 ℃，观察G′、G″、tanδ（损耗角正切，tanδ=G″/G′）随角频率的变化情况，探究不同SUC 浓度对EP 黏弹性的影响。

触变性测定：对添加不同SUC 浓度的EP 溶液进行旋转测量-3ITT 测量，测定温度25 ℃，分别在0.1 s-1、100 s-1、0.1 s-1剪切速率下测量EP 结构破坏和恢复过程，探究经过较大剪切速率后含有不同SUC 浓度的EP 黏度恢复能力。

1.2.3 持水能力测定 分别制备1 mL 不同浓度的EP-SUC 复配凝胶溶液，置于1.5 mL 离心管中，称量装有凝胶样品的离心管质量m1。于4000 r/min 离心30 min，出去上层水后再次称量凝胶样品与离心管质量m2，称量空离心管质量m[23]。根据以下公式计算凝胶持水能力：

1.2.4 傅立叶红外光谱（FTIR）测试 对添加不同SUC 浓度的EP 溶液进行傅立叶红外光谱测试。测试前将不同浓度EP-SUC 复配凝胶进行冷冻干燥，烘干至恒质量，且样品表面及内部无明显水分。采用ATR 测试方法[24]制备红外扫描用样品，即取少量样品置于金刚石ATR 模块中，波数范围4000～600 cm-1，扫描次数32，分辨率4 cm-1，记录样品的红外光谱。

1.2.5 扫描电镜（SEM）测试 对添加不同SUC 浓度的EP 溶液进行扫描电镜测试。测试前将不同浓度EP-SUC 复配凝胶冷冻干燥至样品表面及内部无明显水分。取微量样品直接粘到导电胶上，并使用SC7620 溅射镀膜仪喷金45 s，工作电流为10 mA；随后使用TESCAN MIRA LMS 扫描电子显微镜观察样品形貌[25]。

1.3 数据处理

实验重复三次所得数据使用GraphPad Prism 8.0.1 绘制相关图表，采用SPSS 23.0 软件对多组样本进行样本间差异显著性分析，P<0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 EP 凝胶的流变特性研究

如图1A 所示，在测定剪切速率范围内（0.1～1000 s-1），各浓度EP 均随着剪切速率的增大而减小，呈现出剪切稀化的假塑性流体特征，这一特征在天然植物提取多糖中较为常见，例如银耳多糖凝胶[26]、铁皮石斛多糖凝胶[27]，均属于假塑性流体。剪切稀化对食品加工过程有重要影响，在高剪切速率的物料体系中，加入假塑性流体特征的多糖可以改进物料输送和灌注工艺，使能量消耗减少，易于加工成型[25]。如图1B 所示，在1 s-1剪切速率条件下，浓度为30 mg/mL时，EP 的黏度约为23 Pa·s，当浓度增至50 mg/mL时，黏度可提升至60 Pa·s，这个过程可能是由于EP浓度升高使得分子链间作用加强，从而形成更加稳定的网络结构或缠绕结构[28]，使流体流动阻力增大。然而，浓度范围在50～70 mg/mL 时，黏度随浓度变化的趋势并不显著（P>0.05），而此时EP 凝胶尚处于流动状态，推测这个阶段依靠EP 分子形成的凝胶网络可能出现卷曲，将部分化学键或基团包裹于内部[29]，

图1 不同浓度EP 对凝胶黏度的影响Fig.1 Effect of EP concentration on gel viscosity

削弱了凝胶的黏度。有研究表明，质量浓度过高时，水溶性多糖倾向于发送分子间缔合形成沉淀，导致黏度降低[28]。因此，为了拓展EP 凝胶的应用范围，需要建立复配体系增加EP 凝胶的黏度。

2.2 不同浓度EP-SUC 复合凝胶黏度测定

如图2A 所示，不同浓度EP-SUC 复合凝胶的黏度在剪切速率0.1～1000 s-1范围内，同样随着剪切速率的增加而逐渐降低，呈现出假塑性流体特征，表明添加SUC 并不会改变EP 的流体类型。此外，在同一剪切速率下，随着SUC 添加量增大，EP-SUC 复合凝胶的黏度显著增大（P<0.05），表明SUC 可以适当增加EP 的黏度（图2B）。但可以观察到，相较浓度0.3 g/mL，添加0.4 g/mL SUC 的EP 凝胶黏度反而略有下降，表明EP-SUC 复合凝胶可能存在凝胶临界点，超过临界点时，SUC 和EP 分子很可能发生聚集[24]，导致黏度出现下降趋势。

图2 不同浓度EP-SUC 复合凝胶流变特性曲线Fig.2 Rheological characteristic curves of EP-SUC composite gel with different concentrations

2.3 不同浓度EP-SUC 复合凝胶动态黏弹性测定

线性黏弹区是指在一个范围的应变下储能模量G′能够保持基本不变的区域，即可执行测试而不破坏样品结构的范围。因此，在对样品的动态黏弹性进行分析时，首先需要确认线性黏弹区内的应力范围[30]。如图3 所示，在EP 中加入不同浓度SUC 的样品，其G′在0.1%～100%剪切应变范围内均基本无显著变化，所以0.1%～100%为EP 的线性黏弹区。

图3 不同浓度EP-SUC 复合凝胶的线性黏弹区测定Fig.3 Linear viscoelastic region determination of EP-SUC composite gel

如图4 结果显示，含有不同浓度SUC 的EP-SUC的复合凝胶，其G′均大于G″（即tanδ<1），当tanδ<1时，体系主要表现为固体弹性特征[31]，这个结果表明不论是EP 凝胶还是SUC-EP 复合凝胶，其弹性在黏弹性中均占主导地位，并处于类固体的凝胶状态。此外，在SUC 浓度较低的范围内，随着SUC 浓度的增加，G′和G″也相应增大（图4A～图4C），并在SUC 浓度为0.3 g/mL 时分别达到最大值，继续提高SUC 浓度，G′和G″反而下降，并出现G′和G″曲线间距缩小的现象（图4D），表明此时凝胶强度减弱。有研究表明，当物质浓度过高时，由热诱导方式形成的凝胶会出现不均匀的分子聚集，导致凝胶结构收缩，强度减弱[32]；此外，由图5 可知，EP 和EP-SUC 的tanδ值始终介于0.01～1 范围内，表明二者均为弹性大于黏度，SUC的加入没有改变这个特性。

图4 不同浓度EP-SUC 复合凝胶在角频率下模量的变化Fig.4 Changes in modulus of EP-SUC composite gel with different concentrations at angular frequency

图5 不同浓度EP-SUC 复合凝胶在角频率下tanδ 的变化Fig.5 Changes of tanδ of EP-SUC composite gels with different concentrations at angular frequencies

综上所述，EP 凝胶及EP-SUC 复合凝胶的黏弹性呈现明显不同，即低SUC 浓度范围内（小于0.3 g/mL），SUC 能增加复配体系黏弹性；在高SUC 浓度范围（大于0.3 g/mL），SUC 反而降低了复配体系黏弹性，根据类似水溶性多糖凝胶形成机制的研究[33]，SUC 对EP 凝胶体系黏弹性的影响可能与EP 化学基团改变相关。

2.4 不同浓度EP-SUC 复合凝胶触变性测定

触变性指物质经过较大剪切速率作用后，在小剪切速率下物质仍能恢复原有结构的能力。触变性作为一种可逆的溶胶现象，反映了物质黏度与剪切时间的关系，和物质被打破结构之后重建的能力[34]。如图6A 所示，6～60 s 为低剪切速率段（γ=0.1 s-1），此时EP 的黏度均处于较高水平。61～65 s 为高剪切速率段（γ=100 s-1），EP 在高剪切速率下结构可能被破坏，表现为黏度突然降低。66～185 s 为低剪切速率段（γ=0.1 s-1），黏度有所恢复但并未达到原来的黏度值，显示EP 重建的结构，与原先结构仍有不同。经高剪切后60 s 黏度恢复程度如图6B 所示，随着SUC 浓度的增加，EP 黏度值的恢复程度也相应增大，并在SUC 浓度为0.3 g/mL 时达到最大值63.59%，之后继续增加SUC 浓度不再显著提高EP 黏度值的恢复程度。因此，浓度低于0.3 g/mL 的SUC 溶液能显著提高EP 黏度值的恢复程度，意味着在一定浓度范围内的SUC 有助于EP 凝胶的结构重建。

图6 不同浓度EP-SUC 复合凝胶触变性变化Fig.6 Thixotropy of EP-SUC composite gel at different concentrations

2.5 不同浓度SUC-EP 复合凝胶持水能力测定

此外，SUC 对EP 凝胶持水能力也有显著影响，如图7 所示，EP 凝胶持水力约为77%，当添加0.3 g/mL SUC 后，持水能力显著增强（P<0.05），表明此时凝胶网状结构限制水分子迁移的能力很强，其原因可能是SUC 的多羟基结构对水分子有较强的吸附力，另外，在SUC 的存在情况下，多糖分子之间形成更多的氢键，从而增加凝胶的持水能力，这一结果与SUC对果胶持水能力影响的研究结果一致[20]。而当SUC浓度达到0.4 g/mL 时，持水能力有所下降，表明过量SUC 导致凝胶网络可能出现空隙，吸附水分子的能力减弱，其原因可能与上述的氢键数量减少有关。

图7 不同浓度SUC 对EP 凝胶持水能力的影响Fig.7 Effect of SUC with different concentrations on waterholding capacity of EP gel

2.6 不同浓度SUC 对EP 结构的影响

如图8 所示，不同SUC 浓度复合凝胶在3400～3200 cm-1均出现宽而强的吸收峰，表现为不饱和的缔合O-H 伸缩振动[9]；在1680～1620 cm-1处出现很弱的吸收峰，表现为C=C 伸缩振动[11]；在1430 cm-1附近出现O-H 弯曲振动峰[9]；在1300～1000 cm-1处存在多个C-O 伸缩振动，1105.40 cm-1附近存在醚类物质C-O-C 的吸收峰；这些官能团构成了EP 凝胶的基本结构骨架。在880～680 cm-1处出现的硫酸基团S-O 的反对称伸缩振动[27]，再次证明EP 是硫酸化的多糖。相较于单纯EP 凝胶，SUC-EP 复合凝胶在2926±10 cm-1范围内还多出现了一个弱吸收峰，即-CH2的不对称伸缩振动峰[28]，表明-CH2基团更可能与其他侧链相互作用，从而对EP 的结构产生一定的影响[35]。当SUC 浓度由0 g/mL 升高至0.3 g/mL时，3296.57、3264.83、3261.20、3265.85 cm-1的O-H振动峰的逐渐增强，且羟基伸缩振动峰向低波长方向迁移，表明这个过程氢键是维持凝胶结构的主导作用力，并随着SUC 浓度升高氢键数目逐渐增加，而当SUC 浓度达到0.4 g/mL 时，O-H 振动峰开始减弱，表明此时氢键的数量在减少，这可能是由于SUC 疏水性较强，而过量的SUC 降低了系统水分活度，使疏水作用的形成更加容易，削弱了氢键的作用，导致凝胶强度减弱[36]，类似的结果在SUC 和大豆多糖的复合凝胶体系中也被观察到[37]。

图8 不同浓度EP-SUC 复合凝胶傅立叶红外光谱图Fig.8 Fourier infrared spectrum of different concentrations of EP-SUC composite gels

2.7 不同浓度EP-SUC 复合凝胶微观结构分析

由图9 可知，含有不同浓度SUC 的EP-SUC 复合凝胶的微观结构具有明显差异。其中，单纯EP 凝胶（图9A）的微观结构较为松散，孔隙较大，呈现为片状结构，同时伴有卷曲现象。加入SUC 后，EP 凝胶的基质愈发细密化，且断面结构也愈加平整，孔隙也呈降低趋势，这种趋势在含有0.3 g/mL SUC 的SUCEP 复合凝胶上表现最为显著，其凝胶微观结构均一，排列较为整齐规律，呈现连续的立体菱形状结构（图9C）。当SUC 浓度达到0.4 g/mL 时，其凝胶结构致密度反而下降，孔隙开始变大，立体菱形状结构被削弱，表现为立体菱形状和平面片状结构并存。这表明在一定浓度范围内，SUC 的加入能够强化EP 的微观结构，而超过该浓度范围后，SUC 则削弱了复合凝胶的微观结构，这个削弱现象与上述黏弹性、红外光谱、持水能力等结果一致，即当SUC 浓度达到0.4 g/mL 时，维持EP 凝胶结构的氢键减少，凝胶弹性降低，持水能力下降。因此，向60 mg/mL EP 中添加0.3 g/mL SUC 可以获得结构致密、高弹性、高持水性的复合凝胶。

图9 不同浓度SUC-EP 复合凝胶的扫描电子显微镜图（2000×）Fig.9 SEM of different concentrations of SUC-EP composite gels (2000×)

3 结论

本研究通过添加不同浓度SUC 构建EP-SUC复合凝胶体系，并考察了凝胶的流变学特性和结构。结果表明，添加SUC 会对EP 的动态流变特性产生影响，在低于0.3 g/mL 的浓度范围内，随着SUC 的添加，EP 的黏度增大、弹性和黏性增加、持水能力增强、经高剪切速率破坏后的恢复程度也随之提高，但SUC 浓度高于0.3 g/mL 时，SUC 则不再对EP 流变学特性产生显著影响。同时，基于傅立叶红外光谱和微观结构分析，初步判断SUC 分子与水分子及EP分子间的氢键作用在EP 流变学特性中起主要作用。本研究通过分析不同浓度SUC-EP 复合凝胶的流变特性和结构特点，以满足不同产品对黏度、凝胶性及流变学特性的需求，为EP 相关产品的质量、配方和加工条件提供评估参数，从而进一步优化产品品质，进一步高值化利用海洋资源。