盒装豆腐的贮藏特性、腐败菌分离鉴定及腐败特性研究

聂远洋，卢 森，龚艺松，李胜利，李 波,*

（1.河南科技学院食品学院，河南新乡 453003；2.河南省果蔬加工及质量安全控制工程技术研究中心，河南新乡 453003；3.郑州新农源绿色食品有限公司，河南郑州 450199）

豆腐富含蛋白质、维生素、矿物质等营养成分，具有很高的营养价值[1-2]，深受大众喜爱。按照使用凝固剂的不同，豆腐可分为老豆腐（北豆腐）、嫩豆腐（南豆腐）、酸浆豆腐（豆清豆腐）和内酯豆腐[3-6]。豆腐常见的包装方式有盒装和散装，其中较大规模的豆制品企业一般采用塑料盒密封包装的方式，而豆腐作坊一般采用大块散装的方式[7]。盒装豆腐采用巴氏杀菌，卫生安全，产品质量稳定。但由于豆腐含水量高、营养丰富，容易发生腐败变质，导致豆腐产品货架期较短，对豆制品企业扩大销售半径、提高产量规模产生较大影响，也容易引发食品安全问题[8]。因此，如何有效控制盒装豆腐的微生物数量，延长产品的保藏期，是提升豆制品企业竞争力亟待解决的问题。

已有研究表明，豆腐产地、种类、生产季节、加工工艺、包装方式和贮藏条件的不同可能会导致豆腐腐败菌种类的差异。韩翠萍等[9]从散装豆腐和盒装豆腐中分离出4 株优势腐败微生物，分别为溶血性葡萄球菌、克假丝酵母、短芽孢杆菌、托尔豪特链球菌。王宸之等[10]在全豆豆腐中分离出蜡状芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。郑玉玺等[11]在不同产地不同盒装豆腐中分离出枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌。吴丽樱[12]在盒装内酯豆腐中分离出枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌，在简易包装老豆腐中分离出库特氏菌、荧光假单胞菌、肠膜明串珠菌和产气肠杆菌。Lee 等[13]在变质豆腐中分离出蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。Rossi 等[14]在小规模豆腐企业生产的豆腐中分离出魏氏菌属、乳酸乳球菌、肠球菌等。Ananchaipattana 等[15]在豆腐样品中分离出大肠杆菌、假单胞菌、乳酸菌、葡萄球菌和芽孢杆菌等。Fouad 等[16]在2～3 ℃保存的真空包装豆腐分离出了乳酸菌、肠道细菌和假单胞菌属。然而，不同种类的腐败菌与豆腐的腐败性状相关性如何，不同腐败阶段何种腐败菌发挥主要作用等，还鲜有研究。

河南是人口大省和豆腐消费大省，也是北豆腐或老豆腐的典型产区。目前有关河南地区盒装豆腐腐败微生物的研究鲜有报道。本文以河南省豆制品龙头企业—郑州新农源绿色食品有限公司生产的盒装老豆腐和内酯豆腐为研究对象，研究不同贮藏温度下盒装豆腐的保存期，并对其腐败微生物进行分离鉴定，通过回接实验探明主要微生物生长导致豆腐腐败的腐败性状，以期为盒装豆腐生产和贮运过程中的微生物控制提供理论依据，并为企业下一步开发有针对性的芽孢控制技术提供菌种来源。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

盒装老豆腐（L）、盒装内酯豆腐（N） 郑州新农源绿色食品有限公司；营养琼脂培养基、营养肉汤培养基 广东环凯微生物科技有限公司；氯化钠 天津市大茂化学试剂厂；细菌基因组DNA 提取试剂盒、λDNA HindIII Marker、D2000 DNA Marker、ddH2O、2×Taq PCR MasterMix II 天根生化科技（北京）有限公司；革兰氏染色试剂盒、50×TAE 电泳缓冲液、6×DNA 上样缓冲液 北京索莱宝科技有限公司；琼脂糖、Goldview 核酸染料 北京兰杰柯科技有限公司；琼脂糖凝胶DNA 小量回收试剂盒 广州美基生物科技有限公司；16S rRNA 通用引物（27F 和1492R） 生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

XFH-50CA 电热式压力蒸汽灭菌器 浙江新丰医疗器械有限公司；SW-CJ-2D 超净工作台 上海尚道仪器制造有限公司；ME104E 电子天平 托利多仪器（上海）有限公司；SPX-250B 生化培养箱 上海坤天实验室仪器有限公司；Axio Vert.A1 倒置显微镜德国卡尔蔡司显微镜有限公司；Pico 17 高速离心机赛默飞世尔（中国）有限公司；TProfessionaL standard 96 Gradient 梯度PCR 仪 德国耶拿分析仪器股份公司；JY600 电泳仪 北京君意东方电泳设备有限公司；Tanon-5200MuLti 全自动凝胶图像分析系统上海天能科技有限公司；FE28-Micro pH 计 梅特勒-托里多仪器（上海）有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品采集与处理 取生产线上经巴氏杀菌并冷却后的新鲜盒装老豆腐和内酯豆腐，2 h 内由2～8 ℃冷藏车运输至实验室。新鲜样品立即进行感官评价和菌落总数测定，并分离腐败菌。其余样品分别在4、25、37 ℃下放置，分别每隔3 d、12 h、6 h 进行感官评价和菌落总数测定，直至样品腐败变质。完全腐败后（感官评分低于5.5 分）的样品用于分离腐败菌。不同处理样品标注见表1。

表1 盒装豆腐不同类型和贮藏条件的样品标注Table 1 Sample labeling of boxed tofu for different types and storage conditions

1.2.2 感官评价 选择10 名经过培训的专业人员，参照郑玉玺[17]的感官评分表并稍作修改，对样品的气味、色泽、口感、组织状态进行感官评价。盒装老豆腐和内酯豆腐的感官评价标准分别见表2 和表3。根据Torry[18]方案当样品的感官评分在5.5 分以下时，即认为样品已经达到不可接受状态，即达到腐败标准。

表2 盒装老豆腐感官评价标准Table 2 Sensory evaluation standards of boxed firm tofu

表3 盒装内酯豆腐感官评价标准Table 3 Sensory evaluation standards of boxed lactone tofu

1.2.3 菌落总数的测定 参考GB 4789.2-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数的测定》中所规定的方法对样品的菌落总数进行测定[19]。

1.2.4 腐败菌的分离纯化 无菌操作下取25 g 豆腐样品置于无菌均质袋中，加入225 mL 无菌生理盐水，充分拍打混匀，以10 倍稀释法稀释若干倍。选取合适的稀释梯度，分别吸取200 μL 样液均匀涂布在营养琼脂平板上，置于37 ℃恒温培养箱中倒置培养18～24 h。挑取5～10 个形态特征差异明显的单个菌落，在营养琼脂平板上划线，置于37 ℃恒温培养箱中倒置培养18～24 h。重复上述划线分离步骤，直至得到纯菌株。将纯化后的腐败菌接种至营养肉汤培养基中，37 ℃ 120 r/min 振荡培养18～24 h，取部分培养液用20%甘油在-20 ℃保藏菌种，部分培养液用于革兰氏染色和细菌基因组DNA 提取。

1.2.5 腐败菌的形态观察 腐败菌经革兰氏染色后，在显微镜油镜下观察其形态特征，根据染色结果及细胞形态简单分类。

1.2.6 腐败菌的16S rRNA 分子鉴定 采用细菌基因组DNA 提取试剂盒提取腐败菌基因组DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像系统检测提取结果，然后进行16S rRNA PCR 扩增。通用引物[20]：27F 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R 5’-GGT TACCTTGTTACGACTT-3’。PCR 反应体系（50 μL）：模板DNA 4 μL，引物27F 2 μL，引物1492R 2 μL，2×Taq PCR MasterMix 25 μL，ddH2O 17 μL。PCR 扩增条件：94 ℃预变性5 min，30 个循环（94 ℃变性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s），72 ℃延伸7 min。PCR 扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，切下长度1500 bp 左右目标条带，采用琼脂糖凝胶DNA 小量回收试剂盒纯化PCR 产物。纯化产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。获得的序列在NCBI 上利用BLAST 搜索与已知种属最接近的序列，进行同源性比对分析。

1.2.7 腐败菌回接 取样新鲜老豆腐和内酯豆腐，在无菌环境下分割成4 cm×4 cm×4 cm 的小块，放入无菌袋中，95 ℃杀菌30 min，以减少样品初始菌量，冷却至室温备用。

保藏菌种解冻后，接种至营养肉汤培养基中，37 ℃ 120 r/min 振荡培养24 h，菌落计数确定活化腐败菌的浓度，根据新鲜豆腐样品的质量添加菌液，腐败菌的添加量为103CFU/g，用无菌涂布棒将菌液均匀涂抹于豆腐表面，随即密封。腐败菌回接后的豆腐样品在25 ℃下贮藏，每隔12 h 记录其腐败特征，测定菌落总数和pH。

1.2.8 腐败特征的描述 记录腐败菌回接样品贮藏过程中是否出现发酸、发臭、发黏、褐变、产生刺激性气味、胀袋等腐败特征。

1.2.9 pH 的测定 无菌操作下取25 g 样品，置于无菌均质袋中，加入225 mL 灭菌生理盐水，充分拍打混匀，制成10-1稀释液，用pH 计测定pH。

1.3 数据处理

所有数据均以平均值±标准差（n＝3）表示。采用SPSS 20.0 软件进行统计分析，显著性差异分析为单因素方差分析，多重比较采用LSD 检验，P<0.05具有显著性差异。采用Origin 2021 软件作图。

2 结果与分析

2.1 贮藏温度对盒装豆腐保存期的影响

豆腐的保存期可分别用感官评分和菌落总数进行评价。当感官评分为5.5 时，可认为豆腐样品已达到感官拒绝状态。一般认为，食品能被接受的最大微生物限量值为7 lg CFU/g[21-22]。将盒装老豆腐和内酯豆腐分别置于4、25、37 ℃进行贮藏，分别每隔3 d、12 h、6 h 进行感官评价和菌落总数测定，其在贮藏期间的感官评分和菌落总数变化见图1～图3。

图1 4 ℃贮藏盒装豆腐感官评分和菌落总数变化Fig.1 Changes of sensory score and total number of colonies of boxed tofu stored at 4 ℃

图2 25 ℃贮藏盒装豆腐感官评分和菌落总数变化Fig.2 Changes of sensory score and total number of colonies of boxed tofu stored at 25 ℃

图3 37 ℃贮藏盒装豆腐感官评分和菌落总数变化Fig.3 Changes of sensory score and total number of colonies of boxed tofu stored at 37 ℃

结果显示，贮藏温度为4 ℃时，盒装豆腐在30 d时仍未达到感官拒绝状态，菌落总数低于4 lg CFU/g。贮藏温度为25 ℃时，盒装老豆腐和内酯豆腐分别在36 和48 h 左右达到感官拒绝状态，菌落总数均超过7 lg CFU/g。贮藏温度为37 ℃时，盒装老豆腐和内酯豆腐分别在12 和30 h 左右达到感官拒绝状态，菌落总数也超过7 lg CFU/g。由此可见，贮藏温度对盒装豆腐的保存期有较大影响，温度越低保存期越长。

实验结果还显示，盒装内酯豆腐的保存期略长于老豆腐，这与二者的加工方式不同有关。内酯豆腐生产时，豆浆加入凝固剂葡萄糖酸内酯后即进行装盒密封，然后经升温成型，煮后的豆浆与外界环境接触时间较短[23]。老豆腐生产时，豆浆加入凝固剂后要经过蹲脑、压制、分切等处理后才装盒密封，与外界环境接触时间较长，污染残存的微生物数量较多，故保存期较短。此外，当样品达到感官拒绝状态前，其菌落总数已经达到7 lg CFU/g，表明在界定盒装豆腐的腐败标准时，感官评价要迟滞于微生物指标。

通过前期的调研可知，该企业盒装豆腐产品标注的保存期是1～7 ℃下10 d，企业采用冷库贮藏和冷藏车运输，能够较好保持低温环境，但产品运输到超市后的贮藏和销售温度难以保证，有些消费者也未能将所购产品及时置于冰箱中冷藏，导致产品实际的保存期受到较大影响。因此，增强销售商的冷藏意识和管理水平，以及消费者的食品保藏知识，对提升豆腐等易腐食品的安全性、延长保存期、降低销售损耗具有重要意义。

2.2 盒装豆腐中腐败菌的分离纯化结果

从新鲜的和不同温度贮藏后腐败变质的盒装豆腐样品中共分离出52 株不同菌落形态的腐败菌。革兰氏染色结果显示大多数腐败菌为革兰氏阳性菌（40 株），少数腐败菌为革兰氏阴性菌（12 株）；腐败菌在细胞形态上多呈杆状，其中46 株为杆菌，6 株为球菌。部分腐败菌的菌落特征和细胞形态见图4 和图5。韩翠萍等[9]从腐败散装与盒装豆腐中均分离出4 株腐败菌，其中3 株为革兰氏阳性细菌，1 株为革兰氏阳性酵母；郑玉玺[17]从不同产地不同种类豆腐中分离纯化得8 株纯菌株，均为革兰氏阳性菌，其中6 株均为杆菌，2 株为球菌。本研究分离的豆腐腐败菌在革兰氏染色和细胞形态上与前人的研究结果一致，即大部分腐败菌为革兰氏阳性菌，呈杆状。

图4 盒装老豆腐部分腐败菌菌落特征及细胞形态（1000×）Fig.4 Colony characteristics and cell morphology of some spoilage bacteria from boxed firm tofu (1000×)

图5 盒装内酯豆腐部分腐败菌菌落特征及细胞形态（1000×）Fig.5 Colony characteristics and cell morphology of some spoilage bacteria from boxed lactone tofu (1000×)

2.3 盒装豆腐腐败菌的菌种鉴定结果

对盒装豆腐中分离纯化出的腐败菌进行16S rRNA 分子鉴定，结果见表4。

表4 显示，每种豆腐样品的腐败菌为6～7 株。腐败菌主要为芽孢杆菌（共43 株），包括蜡样芽孢杆菌（11 株）、芽孢杆菌属（9 株）、枯草芽孢杆菌（7 株）、地衣芽孢杆菌（3 株）、鲁梅尔芽胞杆菌（3 株）、土壤芽孢杆菌（2 株）、特基拉芽孢杆菌（2 株），赖氨酸芽孢杆菌、苏云金芽胞杆菌、咸海鲜芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌、短芽孢杆菌属、短小芽孢杆菌各1 株。其他腐败菌包括金黄杆菌属、屎肠球菌、耐久肠球菌各2 株，成团泛菌、葡萄球菌、乳微杆菌各1 株。由此可见，芽孢杆菌是盒装豆腐腐败菌中的优势菌，这与郑玉玺等[11]、吴丽樱等[24]、王敏等[25]的研究结果一致。

表5 显示，豆腐类型和贮藏温度对腐败菌的种类也有一定影响。贮藏温度对盒装内酯豆腐腐败菌多样性的影响较大，对盒装老豆腐影响较小，而且4 和25 ℃贮藏的盒装内酯豆腐腐败菌种类比其他样品都要丰富。当贮藏温度为4 ℃时，盒装内酯豆腐中的腐败菌为芽孢杆菌属（1 株）、肠球菌属（2 株）和金黄杆菌属（2 株）。其余样品中腐败菌多为芽孢杆菌属。由于低温会显著抑制大多数微生物的代谢活动，且4 ℃贮藏样品分离腐败菌时，样品并未达到腐败状态，因此导致4 ℃贮藏盒装老豆腐和盒装内酯豆腐腐败菌种类的差异。同时盒装老豆腐和盒装内酯豆腐两者的加工方式、原辅料、机械化程度的不同都会导致其在不同贮藏温度时腐败菌种类的差异。吴丽樱[12]研究发现不同贮藏温度对简易包装老豆腐的腐败菌菌相有较大影响，郑玉玺[17]报道不同贮藏温度下盒装豆腐腐败菌多样性也会发生较大变化，这与本研究结果相似。

表5 盒装豆腐中腐败菌的分布情况Table 5 Distribution of spoilage bacteria in boxed tofu

2.4 盒装豆腐腐败菌的腐败性状和生长特性

根据腐败菌分离鉴定结果，分别从盒装老豆腐和内酯豆腐中选取出现频率较高的腐败菌各5 株（见表6），将每株菌分别回接到灭菌后的盒装豆腐样品中，在25 ℃下贮藏，观察其腐败性状、菌落总数和pH 的变化情况。

表6 回接实验中选取的腐败菌菌株Table 6 Spoilage strains selected in the back inoculation experiment

2.4.1 腐败菌的腐败性状 表7 和表8 显示，接种腐败菌的盒装老豆腐样品和空白的老豆腐样品25 ℃贮藏时，在24 h 出现腐败性状（枯草芽孢杆菌除外），接种腐败菌的盒装内酯豆腐样品25 ℃贮藏时，在12 h 即出现腐败性状，而空白内酯豆腐样品在24 h出现腐败性状。表明回接腐败菌的内酯豆腐较老豆腐更容易腐败，这可能是由于回接至内酯豆腐中的腐败菌（如成团泛菌、屎肠球菌、短小芽孢杆菌）其代谢分解豆腐中营养物质的速率快于回接至老豆腐中的腐败菌（如耐久肠球菌、土壤芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌）。腐败初期（12～24 h）的性状大体表现为腐败味、发粘等，中期（36～48 h）则表现为酸腐味、发粘、刺激性气味等，后期（60 h）出现臭味、胀袋等性状。老豆腐和内酯豆腐的腐败性状有明显差异，可能与二者的制作工艺、所用凝固剂不同有关[7]，也与二者的含水量、pH 有关[4-6]。不同腐败菌的腐败性状也有一定差异，如蜡样芽孢杆菌会导致老豆腐发生褐变，枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌引起老豆腐胀袋；成团泛菌会在内酯豆腐表面形成一层菌膜，短小芽孢杆菌则在内酯豆腐中产生黏液；不同腐败菌均会引起内酯豆腐产生刺激性气味和胀袋。韩翠萍等[9]发现克假丝酵母、溶血性葡萄球菌及托尔豪特链球菌是导致豆腐发粘、涨袋及质构变软的主要微生物，而短芽孢杆菌对豆腐腐败变质无明显影响。综上，豆腐的不同产地、来源和种类及贮藏时间都会直接影响其腐败进程和性状，豆腐的最终腐败性状也是各种腐败菌综合作用所致。

表7 盒装老豆腐回接腐败菌后的腐败性状Table 7 Spoilage characters of boxed firm tofu after back inoculated with spoilage bacteria

表8 盒装内酯豆腐回接腐败菌后的腐败性状Table 8 Spoilage characters of boxed lactone tofu after back inoculated with spoilage bacteria

2.4.2 腐败菌的生长特性 图6 显示，回接腐败菌后盒装老豆腐样品的菌落总数在前24 h 快速增长，之后趋于平缓。回接枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌样品的菌落总数增速快于空白样品，而回接耐久肠球菌、蜡样芽孢杆菌和土壤芽孢杆菌的增速慢于空白样品，表明枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌可能在盒装老豆腐的腐败初期（12～24 h）发挥主要作用。图7 显示，回接腐败菌后的内酯豆腐样品也是在前24 h 菌落总数增幅较快，之后有所趋缓。回接成团泛菌、枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌样品的菌落总数增速快于空白样品，回接屎肠球菌和短小芽孢杆菌的增速慢于空白样品，结合腐败性状（表8）来看，接种成团泛菌、枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌后12 h 即出现腐败味，而空白在24 h 才出现，表明成团泛菌、枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌可能在盒装内酯豆腐的腐败初期（12～24 h）发挥主要作用。

图6 盒装老豆腐回接腐败菌后的菌落总数变化情况Fig.6 Changes of the total number of colonies of boxed firm tofu after back inoculated with spoilage bacteria

图7 盒装内酯豆腐回接腐败菌后的菌落总数变化情况Fig.7 Changes of the total number of colonies of boxed lactone tofu after back inoculated with spoilage bacteria

2.4.3 pH 的变化情况 图8 和图9 显示，回接腐败菌后的豆腐样品随贮藏时间延长pH 逐渐降低，其中盒装老豆腐样品的pH 从初始的6.5 左右降至60 h最低的5.0 左右，盒装内酯豆腐样品的pH 从初始的5.7 左右降至60 h 最低的4.7 左右，从而导致豆腐在贮藏后期呈现酸腐味或酸臭味。老豆腐样品在贮藏前24 h 的pH 降速较快，与感官评价中的酸腐味出现时间一致（表7），随后降幅趋于平缓，其中枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的pH 变化趋势与空白样品几乎一致，前24 h 的pH 降幅较快，之后则趋于稳定，但始终低于空白样品，结果与其菌落总数的增速快于空白有关（图6）。由于凝固剂的原因，内酯豆腐的初始pH 低于老豆腐，其中屎肠球菌pH 的变化趋势与空白样品接近，而成团泛菌的pH 最低，这与其菌落总数的增长最快有关（图7）。

图8 盒装老豆腐回接腐败菌后pH 的变化情况Fig.8 Changes of pH of boxed firm tofu after back inoculated with spoilage bacteria

图9 盒装内酯豆腐回接腐败菌后pH 的变化情况Fig.9 Changes of pH of boxed lactone tofu after back inoculated with spoilage bacteria

3 结论

贮藏温度对盒装豆腐保存期和主要腐败菌的影响较大。4 ℃贮藏时盒装老豆腐和内酯豆腐的保存期均超过30 d，25 ℃贮藏时盒装老豆腐和内酯豆腐的保存期约为36 和48 h，37 ℃贮藏时盒装老豆腐和内酯豆腐的保存期仅为12 和30 h 左右。因此，增强豆腐销售商的冷藏意识和管理水平，以及消费者的食品保藏知识，有助于提升豆腐等易腐食品的安全性，延长保存期，减少销售损耗。从新鲜和不同温度贮藏腐败变质的盒装豆腐中分离鉴定出52 株腐败菌，主要为芽孢杆菌（共43 株）。贮藏温度对盒装内酯豆腐腐败菌的多样性影响较大，对盒装老豆腐影响较小，且4 和25 ℃盒装内酯豆腐的腐败菌种类较为丰富。分别选取出现频率较高的5 株腐败菌回接到灭菌后的盒装豆腐样品中，盒装内酯豆腐在常温贮藏12 h 出现腐败性状，老豆腐样品在24 h 出现腐败性状（枯草芽孢杆菌除外）。腐败初期（12～24 h）的性状大体表现为腐败味、发粘等，中期（36～48 h）则表现为酸腐味、发粘、刺激性气味等，后期（60 h）出现臭味、胀袋等性状。老豆腐和内酯豆腐的腐败性状有明显差异，不同腐败菌的腐败性状也有一定差异，豆腐的最终腐败性状是各种腐败菌综合作用所致。总体来看，盒装豆腐中残留的耐热芽孢杆菌是后期贮藏过程中导致豆腐腐败的主要菌种，而芽孢由于其极强的抗逆性，在豆腐生产各环节普遍存在，且巴氏杀菌难以彻底杀灭。因此，后续将研究相关芽孢控制技术，如使用微酸性电解水处理生产各环节，采取合适的条件促使芽孢萌发后再对产品进行二次杀菌等，以指导企业生产并延长盒装豆腐的保存期。