基于Nrf2/HO-1通路探讨金雀异黄酮对糖尿病肾病大鼠肾损伤的影响及机制

陈 洁,杨林燕,郝晓娟,何 琦,侯世杰

(邯郸市中心医院,河北 邯郸 056001)

糖尿病肾病是糖尿病最常见的一种微血管并发症,是引发终末期肾病的第二大原因,仅次于慢性肾小球肾炎,具有较高的致残、致死率[1]。病理学研究发现,持续高血糖导致糖脂代谢紊乱,引发氧化应激和炎症反应,破坏肾微血管内皮细胞结构和功能,导致肾小球滤过率降低、肾细胞代偿性增生和组织纤维化[2-3]。由E2相关因子2(Nrf2)及其下游血红素加氧酶1(HO-1)、醌氧化还原酶1(NQO1)组成的信号通路在细胞氧化应激和炎症反应过程中发挥着关键调控作用,激活Nrf2/HO-1信号通路,能够抑制氧化应激和炎症反应而减轻糖尿病肾病肾损伤[4]。金雀异黄酮(又名染料木素)广泛存在于金雀花、大豆、皂荚、槐角等豆科植物中,具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗肿瘤等多种药理学作用[5-6]。既往实验研究证实,金雀异黄酮能够通过调控Nrf2/HO-1信号通路减轻糖尿病大鼠心肌组织损伤[7],可通过调控MAPK/核因子κB(NF-κB)通路减轻糖尿病肾病大鼠肾细胞线粒体损伤[8]。但金雀异黄酮对糖尿病肾病大鼠肾损伤的影响以及是否与调控Nrf2/HO-1信号通路有关尚需进一步研究,故本实验基于该通路探讨了金雀异黄酮对糖尿病肾病大鼠肾损伤的影响及其可能的分子机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 55只清洁级雄性SD品系大鼠,7周龄,体重180～210 g,购于河北伊维沃生物科技有限公司[SCXK(冀)2020-002],在室温23～25 ℃、相对湿度45%～65%、12 h/12 h光暗交替的控制环境中分笼饲养。研究中所有动物操作遵循减少、替代、优化原则。本实验通过邯郸市中心医院伦理委员会审批通过[HDZXLL(K) 2021-018]。

1.2药物与试剂 金雀异黄酮(纯度≥98%)购自上海源叶生物科技有限公司(批号:Y21D5C10382);鸦胆子苦醇(Nrf2抑制剂)、链脲佐菌素(STZ)、马森(Masson)染色试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司(货号分别为IB0520,S8050,G1340);苏木精-伊红(HE)、过碘酸-雪夫(PAS)染色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司(批号分别为C0105M,C0142M);锇酸、醋酸铀、柠檬酸铅购自美国Ted Pella公司(货号分别为19271,21035,20084);肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、尿微量白蛋白(U-mAlb)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-8(IL-8)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所(货号分别为C011-2-1,C013-2-1,E038-1-1,H052-1,H002,H008);总超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)检测试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司(货号分别为YT309,YT292,KFS380);兔源Nrf2、p-Nrf2、HO-1、NQO1、核因子κB(NF-κB)、β-actin、组蛋白H 3(H3)抗体购自北京博奥森生物技术有限公司(批号分别为bs-1074R,bs-2013R,bs-23407R,bs-3485R,bs-0061R,bs-3776R);RIPA裂解液、BCA法蛋白含量检测试剂盒、核蛋白提取试剂盒、羊抗兔IgG二抗、增强化学发光(ECL)试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司(货号分别为R0010,PC0020,R0050,SE134,SW2030)。

1.3主要仪器 One-Touch型动物血糖仪(美国强生公司);HEMIX-180型全自动生化分析仪(日本Sysmex公司);5810型高速低温离心机(德国Eppendorf公司);MK3型酶标仪(芬兰雷勃公司);HI 1220型烤片机、RM 2264型石蜡切片机、EMUC7型超薄切片机(德国Leica公司);JEM-1400型透射电子显微镜(TEM,日本电子株式会社);Powerpac U型垂直电泳系统、Trans-blot型蛋白转膜仪(美国Bio-Rad公司);Chemi Scope 6100型化学发光成像系统(上海勤翔科学仪器有限公司)。

1.4实验方法 随机取10只大鼠作为正常组,剩余的45只大鼠参照祁珊珊等[9]报道方法,采用一次性腹腔注射STZ(60 mg/kg)的方法复制糖尿病肾病大鼠模型。分别于注射STZ后24 h和72 h取尾静脉血检测空腹血糖(FPG),2次检测均FPG≥16.7 mmol/L则判定糖尿病模型制备成功,8周后检测FPG≥16.7 mmol/L且24 h尿微量白蛋白(24hU-mAlb)≥30 mg/L即可判定糖尿病肾病模型制备成功[10]。成模42只,分别剔除24h U-mAlb水平最高和最低各1只大鼠,将剩余的40只糖尿病肾病大鼠随机分为模型组、金雀异黄酮组、鸦胆子苦醇组、金雀异黄酮+鸦胆子苦醇组各10只。参考文献[11-12]给药剂量,金雀异黄酮组给予金雀异黄酮30mg/kg灌胃,鸦胆子苦醇组给予鸦胆子苦醇2 mg/kg灌胃,金雀异黄酮+鸦胆子苦醇组给予金雀异黄酮30 mg/kg+鸦胆子苦醇2 mg/kg灌胃,正常组和模型组给予等体积生理盐水灌胃,均1次/d,连续灌胃6周。

1.5检测指标及方法

1.5.1FPG、SCr、BUN及24hU-mAlb水平 末次灌胃24 h后,由尾静脉采血并通过动物血糖仪检测FPG水平。采用40 mg/kg戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉大鼠,腹主动脉采血,室温静置30min后1 500 r/min(r=10 cm)离心5 min取血清,然后按照试剂盒操作说明,采用肌氨酸氧化酶法检测SCr水平、脲酶法检测BUN水平。末次灌胃完成后,收集各组大鼠24 h尿液,按照试剂盒操作说明,采用免疫比浊法检测24hU-mAlb水平。

1.5.2肾脏指数 末次灌胃24 h后,称量各组大鼠体重后,摘取双侧肾组织,生理盐水冲洗并用滤纸拭干后称重,计算肾脏指数。肾脏指数=(双侧肾重/体重)×100%。

1.5.3肾组织病理形态 取部分左侧肾组织,于10%中性福尔马林溶液中固定72 h,经脱水、石蜡包埋、4 μm切片、展片、55 ℃烤片、脱蜡水化等处理后,分别按照试剂盒操作说明行HE染色、PAS染色和Masson染色,通过光学显微镜观察肾组织病理形态。

1.5.4肾细胞超微结构 取部分左侧肾组织,修饰成1 mm×1 mm×1 mm小块后,加入4%戊二醛溶液4 ℃固定2 h、2%锇酸4 ℃固定2 h,梯度丙酮脱水处理后Epon812包埋树脂进行包埋,60 nm厚度切片,进行醋酸铀和柠檬酸铅电子双染色,然后通过透射电子显微镜观察肾细胞超微结构。

1.5.5肾组织中T-SOD、CAT活性和MDA含量取部分右侧肾组织,冰上剪碎后加入9倍量4 ℃生理盐水,冰上研磨匀浆,3 500 r/min(r=10 cm)离心5 min取上清液,然后按照试剂盒操作说明,采用分光光度法检测T-SOD、CAT活性和MDA含量。

1.5.6肾组织中TNF-α、IL-1β、IL-8含量 取1.5.5制备的肾组织匀浆上清液,采用ELISA法检测TNF-α、IL-1β、IL-8含量。

1.5.7肾组织中Nrf2、p-Nrf2、HO-1、NQO1、总NF-κB、胞核NF-κB蛋白表达情况 采用Western blot法检测:取100 mg右侧肾组织,加入1 mL RIPA裂解液后冰上研磨匀浆,冰上静置30 min后,4 ℃下3 500 r/min(r=10 cm)离心5 min取上清液,4 ℃下12 000 r/min(r=10 cm)离心30 min取沉淀,即为总蛋白;按照胞核蛋白提取试剂盒操作说明制备胞核蛋白。BCA法进行蛋白含量测定,配平后以30 μg/孔上样,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白后转至PVDF膜,5%脱脂奶粉溶液封闭PVDF膜2 h,一抗稀释液Nrf2(1∶1 000)、p-Nrf2(1∶800)、HO-1(1∶1 000)、NQO1(1∶1 000)、NF-κB(1∶1 000)、β-actin(1∶2 000)、H3(1∶2 000)4 ℃避光孵育12 h,洗膜后二抗稀释液IgG(1∶3 000)室温孵育1.5 h,洗膜后ECL显色,通过Image J图像分析软件检测各蛋白条带灰度值。

2 结 果

2.1各组大鼠FPG、SCr、BUN及24hU-mAlb水平比较 模型组大鼠FPG、SCr、BUN及24hU-mAlb水平均明显高于正常组(P均<0.05)。鸦胆子苦醇组大鼠FPG、SCr、BUN及24hU-mAlb水平均明显高于模型组(P均<0.05),金雀异黄酮组和金雀异黄酮+鸦胆子苦醇组大鼠FPG、SCr、BUN及24hU-mAlb水平均明显低于模型组(P均<0.05),但金雀异黄酮+鸦胆子苦醇组大鼠FPG、SCr、BUN及24hU-mAlb水平均明显高于金雀异黄酮组(P均<0.05)。见表1。

表1 正常组和糖尿病肾病各组大鼠FPG、SCr、BUN、24hU-mAlb水平比较

2.2各组大鼠肾脏指数比较 正常组和模型组大鼠的肾脏指数分别为(0.54±0.08)%、(1.17±0.15)%,模型组明显高于正常组(P<0.05)。金雀异黄酮组、鸦胆子苦醇组、金雀异黄酮+鸦胆子苦醇组大鼠的肾脏指数分别为(0.78±0.10)%、(1.36±0.17)%、(0.94±0.13)%,鸦胆子苦醇组明显高于模型组(P<0.05),金雀异黄酮组和金雀异黄酮+鸦胆子苦醇组均明显低于模型组(P均<0.05),但金雀异黄酮+鸦胆子苦醇组明显高于金雀异黄酮组(P<0.05)。

2.3各组大鼠肾组织病理形态比较 正常组大鼠肾小球、肾小管、肾间质形态正常,结构完整,细胞分布均匀。模型组大鼠肾组织HE染色见肾小球肥大,基质增生,系膜扩张,炎性浸润,细胞固缩;PAS染色见肾组织出现糖原沉积、肾小球硬化;Masson染色见肾小球、肾小管、肾间质有大量胶原沉积。与模型组比较,金雀异黄酮组大鼠肾组织病变明显减轻,鸦胆子苦醇组肾组织病变明显加重。与金雀异黄酮组比较,金雀异黄酮+鸦胆子苦醇组肾组织病变明显加重。见图1。

图1 正常组和糖尿病肾病各组大鼠肾组织病理形态(×400)

2.4各组大鼠肾细胞超微结构比较 正常组大鼠肾细胞超微形态、细胞器结构等均未见异常;模型组大鼠肾小球细胞可见足突肿胀或消失,基底膜弥漫性增厚,线粒体嵴断裂或消失;与模型组比较,金雀异黄酮组肾细胞超微结构病变明显减轻,鸦胆子苦醇组肾细胞超微结构病变明显加重;与金雀异黄酮组比较,金雀异黄酮+鸦胆子苦醇组肾细胞超微结构病变明显加重。见图2。

图2 正常组和糖尿病肾病各组大鼠肾细胞超微结构(TEM,×7 000)

2.5各组大鼠肾组织中T-SOD、CAT活性和MDA含量比较 与正常组比较,模型组大鼠肾组织中T-SOD、CAT活性均明显降低(P均<0.05),MDA含量明显升高(P<0.05)。与模型组比较,鸦胆子苦醇组 T-SOD活性明显降低(P<0.05),MDA含量明显升高(P<0.05);金雀异黄酮组T-SOD、CAT活性均明显升高(P均<0.05),MDA含量明显降低(P<0.05)。与金雀异黄酮组比较,金雀异黄酮+鸦胆子苦醇组T-SOD、CAT活性均明显降低(P均<0.05),MDA含量明显升高(P<0.05)。见表2。

表2 正常组和糖尿病肾病各组大鼠肾组织中T-SOD、CAT活性和MDA含量比较

2.6各组大鼠肾组织中TNF-α、IL-1β、IL-8含量比较 模型组大鼠肾组织中TNF-α、IL-1β、IL-8含量均明显高于正常组(P均<0.05)。鸦胆子苦醇组大鼠肾组织中TNF-α、IL-1β、IL-8含量均明显高于模型组(P均<0.05),金雀异黄酮组和金雀异黄酮+鸦胆子苦醇组大鼠肾组织中TNF-α、IL-1β、IL-8含量均明显低于模型组(P均<0.05),但金雀异黄酮+鸦胆子苦醇组大鼠肾组织中TNF-α、IL-1β、IL-8含量均明显高于金雀异黄酮组(P均<0.05)。见表3。

表3 正常组和糖尿病肾病各组大鼠肾组织中TNF-α、IL-1β、IL-8含量比较

2.7各组大鼠肾组织中Nrf2、p-Nrf2、HO-1、NQO1、总NF-κB、胞核NF-κB蛋白表达情况比较与正常组比较,模型组大鼠肾组织中p-Nrf2、HO-1、NQO1蛋白相对表达量及p-Nrf2/Nrf2比值均明显降低(P均<0.05),胞核NF-κB蛋白相对表达量及胞核NF-κB/总NF-κB比值均明显升高(P均<0.05)。与模型组比较,鸦胆子苦醇组大鼠肾组织中p-Nrf2、HO-1、NQO1蛋白相对表达量及p-Nrf2/Nrf2比值均明显降低(P均<0.05),胞核NF-κB蛋白相对表达量及胞核NF-κB/总NF-κB比值均明显升高(P均<0.05);金雀异黄酮组大鼠肾组织中p-Nrf2、HO-1、NQO1蛋白相对表达量及p-Nrf2/Nrf2比值均明显升高(P均<0.05),胞核NF-κB蛋白相对表达量及胞核NF-κB/总NF-κB比值均明显降低(P均<0.05)。与金雀异黄酮组比较,金雀异黄酮+鸦胆子苦醇组大鼠肾组织中 p-Nrf2、HO-1、NQO1蛋白相对表达量及p-Nrf2/Nrf2比值均明显降低(P均<0.05),胞核NF-κB蛋白相对表达量及胞核NF-κB/总NF-κB比值均明显升高(P均<0.05)。见图3及表4。

图3 正常组和糖尿病肾病各组大鼠肾组织中Nrf2、p-Nrf2、HO-1、NQO1、总NF-κB、胞核NF-κB蛋白表达情况

表4 正常组和糖尿病肾病各组大鼠肾组织中各蛋白相对表达量及p-Nrf2/Nrf2、胞核NF-κB/总NF-κB比值比较

3 讨 论

糖尿病肾病主要表现为白蛋白尿及肾小球滤过率持续低下,治疗以降糖调脂、控制血压、改善肾功能等为主,但仍不能有效阻断糖尿病肾病进行性加重以及发展为终末期肾病的结局。中医根据糖尿病肾病的症状将其归于“消渴”“尿浊”“水肿”“溺毒”等范畴,认为气阴两虚、瘀血阻络、水湿浊毒阻滞为该病的主要病机。近年来,中药及中药提取物防治糖尿病肾病成为医药研究者关注的热点。

本实验采用一次性腹腔注射STZ的方法复制糖尿病肾病模型,观察了金雀异黄酮对肾损伤的影响。结果显示糖尿病肾病大鼠肾功能明显降低,病理观察显示肾小球肥大、基质增生、系膜扩张、炎性浸润、糖原沉积、肾小球硬化、胶原沉积,肾小球细胞可见足突肿胀或消失、基底膜弥漫性增厚、线粒体嵴断裂或消失,与江波等[13]报道一致,但尹江宁等[14]研究结果显示糖尿病肾病大鼠呈现肾小球萎缩,这可能与造模方法不同及糖尿病肾病严重程度不同有关。金雀异黄酮组大鼠肾功能明显改善,肾组织病理性改变和肾小球细胞超微结构病变明显减轻,说明金雀异黄酮能够减轻糖尿病肾病大鼠肾损伤,保护肾功能。

氧化应激和炎症反应是糖尿病肾病发生进展的重要因素。活性氧簇(ROS)是引发氧化应激损伤的物质基础,而长期高血糖可刺激细胞线粒体大量产生ROS,抗氧化酶T-SOD、CAT被过度消耗,破坏体内ROS动态平衡,不能及时清除的ROS将攻击破坏生物膜脂质双分子层结构和DNA、结构蛋白等大分子,并生成有害分子MDA,导致细胞损伤及组织病变[15-16]。并且长期高血糖将导致血管内皮细胞受损,白细胞在受损处聚集并大量释放促炎因子,其中TNF-α可促进炎性细胞浸润,IL-1β和IL-8可促进白细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等聚集并释放炎症因子,从而进一步加重炎症损伤[17]。本实验结果显示,金雀异黄酮组大鼠肾组织中T-SOD、CAT活性明显高于模型组,MDA、TNF-α、IL-1β、IL-8含量明显低于模型组,提示金雀异黄酮能够通过抑制氧化应激和炎症反应减轻糖尿病肾病大鼠肾损伤。

Nrf2是一种核转录因子,其结构中含有6个高度保守的环氧氯丙烷相关蛋白同源结构域(Neh),其中Neh2为Nrf2与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap-1)结合位点,生理状态下以无活性“Nrf2/Keap-1”结合态形式存在于细胞质[18]。ROS可刺激Nrf2磷酸化,促使“Nrf2/Keap-1”解离,p-Nrf2核转位后可与抗氧化反应元件结合,诱导T-SOD、CAT等抗氧化酶转录表达,提高机体抗氧化能力。HO-1和NQO1为Nrf2下游靶蛋白。HO-1为血红素降解限速酶,能够阻止血红素参与氧化应激反应,并且血红素降解产物CO、胆绿素等均为内源性抗氧化剂[19]。NQO1是一种具有抗氧化能力的黄素蛋白酶,可催化醌类及其衍生物还原降解,从而阻止其产生ROS参与氧化应激反应[20]。NF-κB是定位于细胞质的一种核转录因子,核转位后可诱导TNF-α、IL-1β、IL-8等多种炎症因子转录表达,从而加重炎症反应[21],而HO-1具有抑制NF-κB核转位的作用[22]。本研究发现,金雀异黄酮组大鼠肾组织中p-Nrf2、HO-1、NQO1蛋白相对表达量及p-Nrf2/Nrf2比值明显高于模型组,胞核NF-κB蛋白相对表达量及胞核NF-κB/总NF-κB比值明显低于模型组;鸦胆子苦醇组大鼠各检测指标变化趋势与模型组相同且更加严重,鸦胆子苦醇可明显逆转金雀异黄酮对糖尿病肾病大鼠上述指标的调控作用。证实金雀异黄酮抑制糖尿病肾病大鼠氧化应激和炎症反应的作用可能与促进Nrf2/HO-1通路活化、抑制NF-κB核转位有关。

综上所述,金雀异黄酮能够抑制糖尿病肾病大鼠肾组织氧化应激和炎症反应,减轻肾组织病变和肾细胞超微结构病变,其机制可能与促进Nrf2/HO-1通路活化、抑制NF-κB核转位有关,本研究为金雀异黄酮用于糖尿病肾病的防治提供了一定理论依据。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。