基于GSK-3β/β-catenin信号通路探究水蛭素对腹膜纤维化大鼠的干预效果

杨 薇,平高华,姚吉太,张 峥,宋美卿,高 峰

(山西省中医药研究院,山西 太原 030012)

腹膜纤维化为细胞外基质过度聚集于腹膜形成的疾病,是由生长因子、多种细胞因子相互作用导致的,与长期腹膜透析密切相关,可使腹膜增厚,影响透析效果[1-2],但目前对于腹膜纤维化尚无确切治疗措施。水蛭为活血化瘀常用药物,具有通经活络、祛瘀消癥的作用,纤维化发病初期,凝血酶可刺激肾小管上皮细胞分泌单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1),采用水蛭素干预,可通过下调肾间质MCP-1、ICAM-1表达和抑制p38蛋白磷酸化,改善大鼠肾功能,延缓肾间质纤维化进展[3-4],但其对腹膜纤维化是否有影响尚不明确。李林煜等[5]研究报道,腹膜纤维化大鼠腹膜组织中糖原合酶激酶3β(GSK-3β)、β连环蛋白(β-catenin)表达明显升高,药物干预可通过下调GSK-3β、β-catenin表达而减轻腹膜增厚,抑制胶原纤维增加。基于此,本研究探讨了水蛭素对腹膜纤维化大鼠的干预效果及对GSK-3β/β-catenin信号通路的影响,以明确水蛭素干预腹膜纤维化的价值及可能作用机制。

1 实验材料与方法

1.1动物 SPF级SD大鼠60只,6～8周龄,体重(218.0±16.3)g,购自深圳市益诺思生物医药安全评价研究院有限公司,动物许可证号:SYXK(粤)2021-0271。饲养条件:室温(23.0±2.1)℃,相对湿度(55.02±5.33)%,每日光照12 h,自由饮水进食。本次实验操作严格参照动物实验伦理要求相关规定进行。

1.2药物 水蛭素(湖北日升昌新材料科技有限公司,货号:8001-27-2);氯沙坦钾(浙江华海药业股份有限公司,国药准字H20143030)。

1.3主要试剂及仪器 晚期糖基化终末产物(AGEs)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)试剂盒(深圳海思安生物技术有限公司),GSK-3β、β-catenin抗体(武汉益普生物科技有限公司,货号分别为FN-ER0060和CSB-E11307m)。

1.4实验方法 随机取10只大鼠作为正常组,其余50只大鼠参照孟立锋等[6]方法建立腹膜纤维化模型:腹腔注射10%水合氯醛3 mL/kg麻醉大鼠后,切开腹腔,分离其左肾并切除上下极,1周后采用同样方式切除大鼠右肾;实验第3周,在大鼠腹腔内注射4.25%含糖腹膜透析液100 mL/(kg·d),1次/d,连续注射4周,并分别于实验第8,10,12,22,24,26天给予含脂多糖0.6 mg/kg的4.25%含糖腹膜透析液100 mL/(kg·d)腹腔注射,建立腹膜纤维化模型。将40只建模成功大鼠随机分为模型组、水蛭素低剂量组、水蛭素高剂量组、氯沙坦钾组各10只,水蛭素低剂量组给予40 mg/kg水蛭素灌胃,水蛭素高剂量组给予80 mg/kg水蛭素灌胃,氯沙坦钾组给予25 mg/kg氯沙坦钾灌胃,正常组和模型组大鼠给予等量生理盐水灌胃,均1次/d,连续灌胃4周。

1.5观察指标及方法

1.5.1腹膜功能指标 灌胃结束后,腹腔注射4.25%含糖腹膜透析液100 mL/(kg·d),4 h后麻醉大鼠,打开腹膜,将液体取出,计算超滤量和葡萄糖转运量。超滤量=取出液体量-给予的液体量。葡萄糖转运量=(透析液初始葡萄糖浓度×注入透析液量)(透析末葡萄糖浓度×终末透析液出量)。

1.5.2腹膜厚度及腹膜组织病理形态 将大鼠断颈处死,取壁层腹膜,加多聚甲醛固定45 h后进行乙醇脱水处理,石蜡包埋,制作5 μm薄片,脱蜡、脱水后进行HE染色,光学显微镜下观察,并测量6个高倍视野中每个视野3个不同位置的腹膜厚度,取3次测量平均值。

1.5.3血清氧化应激指标水平 取各组大鼠灌胃结束后冻存的血清,解冻后采用ELISA法检测AGEs、MDA、GSH、T-SOD水平。

1.5.4腹膜组织中GSK-3β、β-catenin mRNA表达情况 取各组大鼠冷冻腹膜组织,放入液氮中研磨,使用Takara反转录试剂盒反转录为cDNA。采用RT-PCR法检测,反应体系:模板DNA 1 μL、上下游引物0.5 μL、蒸馏水20 μL;反应条件:95 ℃ 10 min,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,70 ℃ 34 s,共进行35个循环。采用2-△△CT法计算出GSK-3β、β-catenin mRNA相对表达量。采用Primer5.0软件设计引物序列,GSK-3β上游引物序列为5’-TACCCATACGATGTTCCAGAT-3’,下游引物序列为5’-ACCCTGCCCAGGAGTTGCCAC-3’;β-catenin上游引物序列为5’-GAAGATCAAGATCATTGCTCCT-3’,下游引物序列为5’-ACTCCTGCTTGCTGATCCA-3’;内参GAPDH上游引物序列为5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,下游引物序列为5’-AACGCTTCACGAATTTCGCT-3’。

1.5.5腹膜组织中GSK-3β、β-catenin蛋白表达情况 采用 Western blot法检测:取各组大鼠冷冻腹膜组织,冰上溶解,25’min后制作组织匀浆,在组织中加入1 mL裂解液,迅速研磨为匀浆,取1.5 mL配置好裂解液放入离心管离心,采用BCA法进行蛋白变性。上样,进行电泳(80 V 0.5 h,120 V 1 h)、切胶、转膜(300 mA,2 h)处理,室温下,在5%脱脂牛奶中封闭1.5 h,并采用一抗室温孵育1 h,4 ℃过夜;次日取出膜,采用TBST洗3次,每次10 min,加入山羊抗兔二抗室温孵育1 h,TBST洗涤,显色液显色并利用UVP成像仪成像后拍照。以GAPDH为内参, 使用Image J软件定量分析蛋白表达情况。试验重复进行5次。

2 结 果

2.1各组大鼠超滤量、葡萄糖转运量、腹膜厚度比较 与正常组比较,模型组超滤量明显降低(P<0.05),葡萄糖转运量、腹膜厚度均明显升高(P均<0.05);与模型组比较,水蛭素低、高剂量组和氯沙坦钾组超滤量均明显升高(P均<0.05),葡萄糖转运量、腹膜厚度均明显降低(P均<0.05);与水蛭素低剂量组比较,水蛭素高剂量组和氯沙坦钾组超滤量均更高(P均<0.05),葡萄糖转运量、腹膜厚度均更低(P均<0.05),且水蛭素高剂量组超滤量明显高于氯沙坦钾组(P<0.05),葡萄糖转运量、腹膜厚度均明显低于氯沙坦钾组(P均<0.05)。见表1。

表1 正常组和腹膜纤维化各组大鼠超滤量、葡萄糖转运量、腹膜厚度比较

2.2各组大鼠腹膜组织病理学形态比较 正常组大鼠腹膜结构正常,细胞为扁平间皮细胞;模型组大鼠细胞出现炎性浸润,间皮细胞为圆形、柱形,间皮细胞下基质增厚;水蛭素低剂量组大鼠腹膜结构与模型组相似;水蛭素高剂量组、氯沙坦钾组大鼠炎性浸润减少,间皮细胞排列整齐,细胞转化为扁平形。见图1。

图1 正常组和腹膜纤维化各组大鼠腹膜组织HE染色病理形态(×400)

2.3各组大鼠血清氧化应激指标水平比较 与正常组比较,模型组血清AGEs、MDA水平均明显升高(P均<0.05),血清GSH、T-SOD水平均明显降低(P均<0.05);与模型组比较,水蛭素低、高剂量组和氯沙坦钾组血清AGEs、MDA水平均明显降低(P均<0.05),血清GSH、T-SOD水平均明显升高(P均<0.05);与水蛭素低剂量组比较,水蛭素高剂量组和氯沙坦钾组血清AGEs、MDA水平均更低(P均<0.05),血清GSH、T-SOD水平均更高(P均<0.05),且水蛭素高剂量组血清AGEs、MDA水平均明显低于氯沙坦钾组(P<0.05),血清GSH、T-SOD水平均明显高于氯沙坦钾组(P均<0.05)。见表2。

表2 正常组和腹膜纤维化各组大鼠血清氧化应激指标水平比较

2.4各组大鼠腹膜组织中GSK-3β、β-catenin mRNA相对表达量比较 模型组GSK-3β、β-catenin mRNA相对表达量均明显高于正常组(P均<0.05);水蛭素低、高剂量组和氯沙坦钾组GSK-3β、β-catenin mRNA相对表达量均明显低于模型组(P<0.05),且水蛭素高剂量组和氯沙坦钾组GSK-3β、β-catenin mRNA相对表达量均明显低于水蛭素低剂量组(P均<0.05),水蛭素高剂量组均明显低于氯沙坦钾组(P均<0.05)。见表3。

表3 正常组和腹膜纤维化各组大鼠腹膜组织中GSK-3β、β-catenin mRNA相对表达量比较

2.5各组大鼠腹膜组织GSK-3β、β-catenin蛋白相对表达量比较 模型组GSK-3β、β-catenin蛋白相对表达量均明显高于正常组(P均<0.05);水蛭素低、高剂量组和氯沙坦钾组GSK-3β、β-catenin 蛋白相对表达量均明显低于模型组(P<0.05),且水蛭素高剂量组和氯沙坦钾组GSK-3β、β-catenin 蛋白相对表达量均明显低于水蛭素低剂量组(P均<0.05),水蛭素高剂量组均明显低于氯沙坦钾组(P均<0.05)。见图2及表4。

图2 正常组和腹膜纤维化各组大鼠腹膜组织中GSK-3β、β-catenin蛋白表达条带图

表4 正常组和腹膜纤维化各组大鼠腹膜组织中GSK-3β、β-catenin 蛋白相对表达量比较

3 讨 论

腹膜纤维化为腹膜的急性/慢性炎症和感染、损伤所致,主要与腹膜透析液刺激有关[7-8]。腹膜细胞损伤,出现纤维化样、腹膜间皮-间充质转化,可对腹膜生理功能造成较大影响,使腹膜超滤功能丧失,故明确腹膜纤维化发病机制,干扰腹膜纤维化形成过程在腹膜纤维化研究中非常重要[9-11]。

水蛭素为多肽物质,具有抗炎、抗纤维的作用,其可通过抑制JAK/STAT3信号通路逆转转化生长因子-β1(TGF-β1)刺激的肾小管上皮细胞异常增殖和纤维化[12]。贺彬等[13]研究报道,水蛭素可以明显减轻博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化,减轻肺组织炎症反应,减少细胞外基质沉积,机制可能与调控p38 MAPK/NF-κB信号通路有关。本研究发现,水蛭素低、高剂量组超滤量明显高于模型组,葡萄糖转运量、腹膜厚度均明显低于模型组,腹膜纤维化改变明显减轻,提示水蛭素可抑制腹膜纤维化的发展。

目前研究显示,腹膜纤维化的发生发展与氧化应激反应密切相关,腹膜细胞暴露于高糖透析溶液中,可使葡萄糖降解产物发生非酶化学反应,产生AGEs,导致细胞内蛋白形态学改变,并引发腹膜纤维化[14]。唐阁等[15]实验研究发现,腹膜组织上AGEs可刺激单核巨噬细胞分泌炎症因子,使氧化应激反应加重,并促进细胞外基质合成,导致腹膜纤维化。本实验结果显示,与模型组比较,水蛭素低、高剂量组血清AGEs、MDA水平均明显降低,血清GSH、T-SOD水平均明显升高,表明水蛭素可抑制氧化应激反应,从而延缓腹膜纤维化的发展。

GSK-3β/β-catenin通路异常活化可导致器官纤维化,其中GSK-3β磷酸化可抑制β-catenin泛素化活性,使β-catenin集聚于蛋白内,并迁移至细胞核[16]。机体长期进行腹膜透析,可改变腹膜形态、功能,增加腹膜溶质转运,形成腹膜纤维化,激活GSK-3β/β-catenin通路,介导腹膜间皮细胞上皮间质转化,增加细胞外基质沉积,导致腹膜功能退化,且腹膜透析液中GSK-3β和β-catenin水平与腹膜透析患者发生腹膜纤维化的程度呈正相关[17]。本实验研究发现,水蛭素低、高剂量组腹膜组织中GSK-3β、β-catenin mRNA及蛋白相对表达量均明显低于模型组,且水蛭素高剂量组降低更明显。提示水蛭素可通过调节GSK-3β/β-catenin通路发挥抗腹膜纤维化作用。

综上所述,水蛭素可减轻腹膜纤维化大鼠病理改变,机制可能与抑制氧化应激和GSK-3β/β-catenin通路激活相关。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。