补肺活血胶囊“异病同治”慢性阻塞性肺疾病和特发性肺纤维化的机制探讨

张婷婷,高 梅,曲蒙蒙,严镓文,吉郡珠,余海滨,2

(1. 河南中医药大学,河南 郑州 450000;2. 河南中医药大学第一附属医院,河南 郑州 450000)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD)和特发性肺纤维化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis,IPF)是呼吸系统常见的异质性疾病,均以通气功能障碍为主要特征,其患病率居高不下且迁延难愈,给患者造成了巨大的经济及心理负担。流行病学研究发现,我国40岁以上COPD患者高达9 990万余人[1],预计到2030年将有超过105万人死于COPD[2],是继心血管疾病及中风之后的导致死亡的第3大疾病[3]。COPD的主要病理特征是异常炎症反应导致的气道、血管以及肺实质的改变,以小气道疾病和肺气肿等为主要表现[4]。IPF多发生于50岁以上的中老年人,男性多于女性,其主要病理学特征为肺泡外基质的过度积累所导致的肺部瘢痕组织形成、肺泡结构异常以及肺功能不可逆的丧失[5],是当前社会面临的主要健康问题之一。“异病同治”是指病机相同的不同疾病可以采用同一种方法进行治疗,即“证同则治同”[6]。传统医学认为,COPD可归属为“肺胀”“咳嗽”等范畴,IPF则被冠为“肺痿”“肺痹”之名,二者病变脏腑皆责之肺、脾、肾,其病机均与气虚、痰浊、血瘀有关[7-9]。补肺活血胶囊由黄芪、赤芍、补骨脂3味中药组成,其中黄芪擅补肺脾之气,赤芍长于清热凉血、活血化瘀,二者配伍调气和血,补骨脂则以温肾助阳、纳气平喘为主,全方肺脾肾兼顾且气血阴阳同调,共奏补肺纳肾、益气活血之功。相关研究表明,补肺活血胶囊在治疗COPD及IPF方面具有抗炎、调节免疫、调节蛋白酶-抗蛋白酶平衡、改善肺功能及肺组织损伤等功能[10-12],临床应用颇为广泛,但其作用机制尚未完全明确,仍需进一步深入探讨。本研究旨在从“异病同治”的角度,利用网络药理学方法探讨补肺活血胶囊对COPD及IPF发挥治疗作用的关键成分、核心靶点、生物学进程以及主要信号通路等,并用分子对接技术对关键活性成分及核心靶点蛋白进行初步验证,进一步明确其分子作用机制,以期为临床用药及后续实验研究提供方向和依据。

1 材料与方法

1.1筛选补肺活血胶囊活性成分及靶点 通过BATMAN-TCM数据库分别以“HUANG QI”“CHI SHAO”“BU GU ZHI”为检索词获取补肺活血胶囊的药物活性成分及相应靶点,以“score cutoff≥20且adjusted P-value≤0.05”为标准进行筛选。

1.2获取补肺活血胶囊与COPD及IPF的交集靶点 分别以“Chronic Obstructive Pulmonary Disease”“Idiopathic Pulmonary Fibrosis”为关键词在GeneCards数据库中获取疾病靶点,并以“Relevance score≥中位数”为条件进行筛选,与从TTD及DisGeNET数据库中检索到的疾病靶点合并去重,然后利用Uniprot数据库对药物与疾病相关靶点进行标准化处理,并用易汉博生物信息在线作图工具(http://www.ehbio.com/ImageGP/index.php/Home/Index/index.html)进行映射,所得交集靶点即为补肺活血胶囊治疗COPD及IPF的共同靶点。

1.3构建“中药-成分-交集靶点”网络及PPI网络 将补肺活血胶囊治疗COPD及IPF的中药、活性成分及交集靶点信息录入Excel,建立相应表格后导入Cytoscape 3.9.1软件,构建“中药-成分-交集靶点”网络,并根据相应度(degree)值筛选主要活性成分,随后利用STRING 11.5在线分析平台对交集靶点构建蛋白-蛋白互作网络(protein-protein interaction networks,PPI),设置物种为人类,置信度(medium confidence)≥0.4,并隐去孤立靶点。

1.4筛选核心靶点 将构建的PPI网络保存为TSV格式并导入Cytoscape软件中,利用Network Analyzer在线工具进行拓扑分析,以“Degree≥2倍中位数”为标准对交集靶点进行筛选,所得靶点即为补肺活血胶囊异病同治COPD及IPF的核心靶点。

1.5核心靶点的GO、KEGG富集分析 运用Metascape数据库对核心靶点进行GO功能及KEGG通路富集分析,物种选择“Homo Spanines”,P-value<0.01,以进一步明确补肺活血胶囊作用于COPD及IPF的共同细胞组分(cellular component, CC)、分子功能(molecular function, MF)、生物过程(biological process, BP)及主要富集的信号通路,并分别根据-logP值及count值选择相应条目,利用微生信平台(http://www.bioinformatics.com.cn/)对其结果进行可视化处理。

1.6分子对接 运用PubChem数据库下载补肺活血胶囊作用于COPD及IPF的前5位活性成分的3D结构,并用OpenBabel 3.1.1软件将其转化为pdb格式。通过RCSB PDB数据库检索度值前5位的核心靶点,设置物种为“Homo Sapiens”,实验方法为X射线衍射法,获取最优评分的PDB ID及其三维结构的pdb文件,并用Pymol软件去除水和小分子配体,随后将主要活性成分及核心靶点分别导入AutoDock Vina软件进行半柔性对接,并选取最优构象利用Pymol软件绘制相应分子对接模式图。

2 结 果

2.1补肺活血胶囊活性成分及靶点的获取 通过检索BATMAN-TCM数据库获得47种药物活性成分及1 109个作用靶点,分别去除重复值后最终得到38种活性成分,其中黄芪23种、赤芍4种、补骨脂11种,对应靶点624个。

2.2补肺活血胶囊与COPD及IPF的交集靶点的获取 通过GeneCards数据库初步获得6 407个COPD靶点及3 509个IPF靶点,筛选后得到3 204个COPD靶点及1 755个IPF靶点。与从DisGeNET和TTD数据库筛选的相应靶点合并去重后获得3 836个COPD靶点和2 139个IPF靶点。将药物与疾病靶点标准化处理后进行映射,并且绘制相应韦恩图,见图1,共得到180个交集靶点。

图1 补肺活血胶囊与COPD和IPF的交集靶点韦恩图

2.3“中药-成分-交集靶点”网络及PPI网络的构建 将相关信息导入Cytoscape 3.9.1软件绘制“中药-成分-交集靶点”网络图,见图2,其中黄色代表补肺活血胶囊中的3味中药,绿色代表相应活性成分,蓝色代表交集靶点。利用Network Analyzer在线工具对该网络进行拓扑分析,筛选到前5位化合物成分分别为异补骨脂素(又称异补骨脂内酯、当归素,angelicin)、刀豆氨酸(canavanine)、豆甾醇(stigmasterol)、补骨脂酚(backuchiol)以及β-谷甾醇(beta-sitosterol),其Degree值分别为33,32,31,27,22。通过STRING数据库对180个交集靶点进行PPI网络分析,见图3,共有180个节点,1 759条边,平均节点度值19.5。表明补肺活血胶囊是通过多种活性成分作用于多个潜在靶点协同参与“异病同治”COPD及IPF的分子机制。

图2 “中药-成分-交集靶点”网络图

2.4核心靶点的筛选 借助Cytoscape软件对PPI网络进行拓扑分析,以Degree≥30为标准筛选到33个核心靶点,主要涉及ALB(Degree:98)、Akt1(Degree:94)、INS(Degree:93)、TNF(Degree:89)、IL1B(Degree:72)等,这些核心靶点即为补肺活血胶囊“异病同治”COPD和IPF的关键靶点。对核心靶点进行可视化,见图4,节点越大、颜色越深说明该靶点在治疗中发挥的作用越重要。

图4 核心靶点网络图

2.5核心靶点的GO、KEGG富集分析 利用Mestascape数据库对33个核心靶点分别进行GO、KEGG富集分析,物种选择人类,P<0.01,共得到975个GO条目以及100条信号通路。GO功能富集分析主要包括对激素的反应、小分子代谢过程的调节、血液循环等902个生物过程以及分泌颗粒管腔、细胞质囊泡腔、囊泡腔以及血小板α颗粒管腔等27个细胞组分和受体配体活性、信号受体激活剂活性、四氢生物蝶呤结合、信号受体调节活性、一氧化氮合酶调节活性等46个分子功能。按-logP值对其结果进行排序,分别取前10条条目进行可视化,绘制相应圈图见图5。由外自内第1圈表示富集的分类及相应条目编号;第2圈表示该条目中的总基因数,颜色越深代表-log10(p-value)值越大;第3圈表示该条目富集的核心靶点基因数,即count值;第4圈表示该条目富集的核心靶点基因数与该条目总基因数的比值,即RichFactor值。KEGG通路富集分析共得到100条信号通路。结果显示,核心靶点基因主要涉及癌症通路、HIF-1信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、前列腺癌、PI3K-Akt信号通路、癌症中的蛋白聚糖、化学致癌-受体激活、雌激素信号通路、松弛素信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、破骨细胞分化等。按count值取前20条条目绘制气泡图,见图6。说明补肺活血胶囊异病同治COPD及IPF主要是通过多种信号通路共同完成的,其中HIF-1信号通路可能是其发挥治疗作用的主要信号通路,利用KEGG PATHWAY Database在线平台(https://www.genome.jp/kegg/pathway.html)绘制相应信号通路图,见图7。

图5 GO功能富集分析圈图

图6 KEGG通路富集分析气泡图

图7 HIF-1信号通路图

2.6分子对接结果 将核心靶点蛋白ALB(PDB ID:6M4R)、Akt1(PDB ID:3OS5)、INS(PDB ID:5W2H)、TNF(PDB ID:1TNR)、IL1B(PDB ID:1HIB)与主要活性成分异补骨脂素、刀豆氨酸、豆甾醇、补骨脂酚以及β-豆甾醇进行分子对接,借助JShare在线工具(https://jshare.com.cn/demos/hhhhiz)对分子对接结果绘制相应热图,见图8,颜色越深表示配体与受体间的结合能越低,说明其结合活性越好。研究发现,若分子对接结合能<-4.25 kcal/mol,说明活性成分与靶点蛋白间有一定的结合活性;若结合能<-5.0 kcal/mol,说明二者结合性能较好;若结合能<-7.0 kcal/mol,说明两者结合活性较高,其分子对接的构象较稳定。分子对接结果显示,所有活性成分与靶点蛋白间均能自由结合并且形成氢键,且除TNF与Canavanine外均能较好结合[13-14]。利用Pymol软件将分子对接结合能≤-10.0 kcal/mol的结果进行可视化,见图9。

图8 分子对接热图

图9 部分分子对接结果模式图

3 讨 论

本研究采用网络药理学方法筛选出补肺活血胶囊主要活性成分包括异补骨脂素、刀豆氨酸、豆甾醇等,其中异补骨脂素可作用于33个COPD及IPF的相关靶点,是补肺活血胶囊发挥“异病同治”作用的首要活性成分。相关研究表明,异补骨脂素不仅能通过显著下调小鼠体内TNF及IL-6的水平,降低脂多糖诱导的炎症细胞数量,以作用于NF-κB和MAPK信号通路来控制炎症反应,减轻肺组织损伤[15];还可以减少体内IL-4、IL-5、IL-13等细胞因子的释放,抑制气道高反应性和NF-κB活化[16];此外,还可以通过调节JNK和ERK通路诱导细胞凋亡,调节细胞周期来抑制癌细胞的生长和转移,发挥抗肿瘤活性[17]。

PPI网络结果表明补肺活血胶囊“异病同治”COPD和IPF主要通过多个潜在靶点共同发挥治疗作用,其中ALB、Akt1、INS、TNF、IL1B等核心靶点尤为重要。相关实验研究结果表明[18],Akt1可以通过上调巨噬细胞中促纤维化细胞因子IL-13的产生来调节肺纤维化,而它的缺乏则会导致胶原蛋白沉积和纤维形成减少;除此之外,Larson-Casey等[19]发现肺泡巨噬细胞中Akt1诱导的线粒体自噬与细胞凋亡抗性以及促纤维化极化有关,这对探索IPF的潜在治疗策略具有重要意义。TNF-α作为一种常见的促炎细胞因子,在许多炎症反应中发挥着至关重要的作用。在IPF患者体内,脂多糖迅速刺激巨噬细胞中TNF-α的产生,然后激活NF-κB通路诱导趋化因子CXCL13基因的表达,进而控制肺中异位淋巴结构的新生[20];另外,当细胞受到TNF-α刺激时,NF-κB与κB位点结合,进一步激活TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性细胞因子,反过来增强炎性反应,加重COPD患者肺组织损伤[21]。一项大型研究发现,IL1B可能是COPD气道炎症的新参与者,它在COPD患者小气道上皮细胞中显著上调,但在肺组织、痰液和血液中没有,推测这可能是由于对外源性刺激以及炎症微环境的反应[22]。由此推测补肺活血胶囊可通过多种活性成分作用于上述靶点,控制COPD和IPF炎症反应的发生发展,从而达到治疗疾病的目的。

GO功能富集分析结果表明补肺活血胶囊主要通过参与对激素的反应、血液循环、调节小分子代谢过程、蛋白质磷酸化以及平滑肌细胞增殖等生物学进程来发挥治疗COPD和IPF的作用,这与COPD和IPF的复杂发病机制以及病理生理学特点相吻合。

KEGG通路富集分析结果显示补肺活血胶囊“异病同治”COPD和IPF主要与HIF-1、PI3K-Akt、TNF等信号通路密切相关。研究表明,大多数慢性炎症性呼吸系统疾病与缺氧有关[23]。COPD和IPF患者的气道通常以慢性炎症、结构改变以及黏液分泌过多所致的气道阻塞等为特征,这可能引起肺局部组织区域耗氧量增加,进一步导致微环境缺氧,反过来影响炎症的消退。当HIF-1信号通路被激活后,与其相关的蛋白HIF-1α在患者肺组织中的过度表达,增加的HIF-1α可以上调肺动脉平滑肌细胞中的血管内皮生长因子(VEGF)及其受体VEGF2,进一步在外周血管生成和气道重塑中发挥作用[24]。PI3K/Akt信号通路作为调节细胞生长、增殖、分化和凋亡的关键信号通路之一,它的激活不仅可以通过调节下游的mTOR、HIF-1α和FoxO等来参与肺纤维化[25],而且可以促进COPD大鼠气道平滑肌细胞的增殖、迁移和黏附[26],极有可能是治疗COPD和IPF的合理治疗位点。

分子对接结果预测出补肺活血胶囊中主要活性成分均可与潜在核心靶点自由结合,一定程度上验证了网络药理学结果的准确性,为后续药理学研究提供了一定的方向。

综上所述,本研究基于“异病同治”理论,利用网络药理学和分子对接技术从分子层面揭示了补肺活血胶囊主要通过多成分、多靶点以及多条信号通路协同发挥“异病同治”COPD和IPF的作用机制。然而,网络药理学方法也存在一定的局限性。首先,相关数据库更新不及时,某些活性成分和靶点尚未被录入或者尚未被研究发现;其次,网络药理学只是把中药组成单纯相加,并未考虑到药物间的配伍关系以及药物含量、浓度等影响因素;最后,网络药理学与分子对接结果均为预测所得,补肺活血胶囊“异病同治”COPD和IPF的潜在分子作用机制仍需进一步的实验验证。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。