复发性自然流产过程中蜕膜自然杀伤细胞相关受体的作用机制研究进展

袁柔刚，赵晓丽，张欣文*

(1.陕西中医药大学第二临床医学院,西安 712046;2.西安市人民医院/西安市第四医院妇女保健中心,西安 710004)

复发性流产(RSA)是妇产科常见的妊娠并发症之一,也是妇产科生殖免疫相关的常见疾病,严重威胁广大女性的身心健康。虽然RSA发病大多有明确的病因,但临床上仍然有许多RSA的触发因素仍未被发现,其中大部分被认为与免疫异常有关。在正常妊娠过程中,各种免疫细胞和细胞因子共同作用,形成一种免疫耐受性,使胚胎能够成功地逃避母体免疫系统。自然杀伤细胞(NK细胞)是近年来免疫学家所关注的热点,这些细胞在负责识别/杀死异常分化、形态学发生异常改变及受到感染的细胞的过程中发挥重要作用。在妊娠过程中,蜕膜自然杀伤细胞(dNK细胞)数量持续增加,且保持与滋养层细胞的密切接触,因而dNK细胞与滋养层细胞在母胎界面的相互作用可以看做是母体对胎儿的同种抗原识别存在免疫耐受从而达到对胎儿免疫保护的细胞基础[1]。埃及亚苏大学医学院的El-Badawy等[2]在对RSA妇女外周血杀伤免疫球蛋白样受体的研究中发现,根据CD16和CD56的相对表达,NK细胞主要包括两种不同的亚群,即CD56dimCD16bright亚群和CD56brightCD16dim亚群。外周血中CD56brightNK细胞占17.5%,蜕膜中CD56brightNK细胞占17.3%;血液和蜕膜中CD56dimNK细胞均高于CD56brightNK细胞。而对于这些细胞的功能,研究发现dNK细胞既可以在母胎界面发挥免疫调节作用[3],同时也在滋养层细胞侵袭和血管重塑的调节中也起着关键作用[4-5]。

这些NK细胞在识别/杀伤靶细胞的过程中,需要依赖NK细胞表面的抑制性受体和激活性受体同靶细胞表面的主要组织相容性复合体(MHC)分子相互作用,使得抑制性信号和激活性信号之间的平衡发生改变所产生的组合信号去识别体内的异常。NK细胞表面受体丰富多样,这些受体与其配体在自然流产的发病过程中可能存在不同的调控作用。NK细胞表面受体主要分为两个家族:免疫球蛋白超家族[包括杀伤免疫球蛋白样受体(KIRs)家族、天然细胞毒受体(NCR)和LIR(白细胞Ig样受体)/ILT(免疫球蛋白样转录本)LIR受体)]和C型凝集素家族[CD94/NKGs和CD94/NKG2受体(自然杀伤基因)、NKG2D受体][6]。在妊娠过程中,它们通过各种免疫调节机制促进母体对胚胎的接受。NK细胞表面受体(Natural killer cell receptor,NKR)是NK细胞活性的中枢调节因子[7]。但是对于各类受体具体的调节机制仍未研究清楚。本文将针对以上所提及的受体及其配体在自然流产中的发病、调控机制的相关研究进展进行综述。

一、杀伤性免疫球蛋白样受体(killer immunoglobulin-like receptor,KIR)

多数调节dNK细胞功能的激活和抑制受体都属于高度多态性的KIR家族。识别人类白细胞抗原HLA-I类分子的KIRs对NK细胞功能尤为重要,在母胎界面只有绒毛外滋养层(EVT)表达选择性HLA-I类分子,所有其他类型的滋养层细胞都没有HLA表达[8]。由于KIR和HLA基因的变异性,每次妊娠都会有一个独特的KIR和HLA-I的组合,这与NK细胞直接与滋养层相互作用的事实相结合,表明KIR和HLA可能在RSA中发挥作用。EVT表达HLA-C、HLA-E及HLA-G[9-10],如果抑制性KIR与自身HLA-I类分子之间相互作用,它们就会抑制dNK细胞的激活,从而损害滋养层细胞[11-12]。

KIRs可以根据它们的结构和功能进行分类。每个KIR分子由两个或三个胞外免疫球蛋白样结构域(分别为2D和3D分子)、一个跨膜区和一个短(S)或长(L)的胞内尾巴组成[11-13]。KIRs在NK细胞亚群上表达,可能影响该细胞的活化,要么通过抑制性KIRs[带有长(L)细胞质尾巴的KIR2DL和KIR3DL,包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIMs)]来抑制细胞激活,要么通过激活性KIRs[KIR2DS和KIR3DS,短(S)细胞质尾巴没有信号基序,但与适配分子DAP12同源二聚体相关,具有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAMs)]来激活细胞。

KIR是表达在NK细胞和T淋巴细胞膜上的跨膜糖蛋白,在与靶细胞表面配体识别相关的NK细胞胞外片段上具有特征性的免疫球蛋白(Ig)样结构域。所有KIR基因都编码在19号染色体(19q14.3)的白细胞受体复合体(LRC)中,LRC包括KIR家族的15个基因,编码KIR的基因具有多态性;LRC中存在的KIR基因除了具有多态性,其数量还存在很强的单倍型变异性;两种类型的KIR单倍型(A和B),可以被KIR家族的15个基因所定义[11-15],即KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR2DL1、KIR2DL2/L3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3D、KIR3DL3和KIR3DS1[10-16]。

目前郑州大学附属人民医院苏宁教授团队进行了关于KIR基因和HLA-C配体影响汉族人口复发性自然流产的研究[16],该研究检测了110例原因不明的RSA汉族女性和105例健康汉族女性的KIR和HLA-C基因,探究是否某些基因型更容易发生流产,结果表明:与对照组相比,RSA患者组KIR3DL1基因频率明显降低,KIR2DS1基因频率明显更高,但是两组KIR基因频率及不同KIR单倍型差异无统计学意义;抑制基因的减少和激活基因的增加可能诱导子宫蜕膜自然杀伤细胞(dNK细胞)的激活,从而降低胎儿存活的概率导致流产的发生。这项研究提示母系KIR和HLA-C基因与中国汉族女性RSA之间存在关联,但是并未对其机制进行更加深入的研究。无论如何,这些研究结果对我们关于KIR受体基因在RSA发生中机制的探索有一定的启示。

二、天然细胞毒受体(natural cytotoxicity receptors,NCR)

NCR隶属于免疫球蛋白超家族,包括自NCR-1(即NKp46)、NCR-2(即NKp44)、NCR-3(即NKp30)[16],这些受体在识别几乎不表达主要组织相容性复合体(MHC)的靶细胞中发挥重要作用。NCR在NK细胞胞外部分也具有免疫球蛋白(Ig)样结构域,因此将之归属于免疫球蛋白超家族。这类受体识别的配体包括应激诱导蛋白(NKG2D的配体)、病毒蛋白(如血凝素)、pp65(NKp44、NKp46和NKp30的配体)及一些尚未鉴定的肿瘤配体[17-18]。

由于NCR缺乏免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAMs),因此它们只能通过含有ITAM的相关分子向胞内传递激活信号[19]。NKp46和NKp30可以在静息状态和激活状态的NK细胞上表达,而NKp44仅在激活的细胞上表达。NKp30可以转录成不同的变异体,其中NKp30a、NKp30b和NKp30c是最丰富的异构体,每个异构体都有不同的功能,NKp30a和NKp30b传递激活信号,而NKp30c传递免疫抑制信号;NKp46和NKp44可以转录成几种异构体,但NKp46没有发现剪接变异体的功能差异,且NKp44存在抑制性异构体[20];此外,3种NCR都被多次证明可以诱导子宫NK细胞的细胞毒作用和细胞因子的产生,但其中只有NKp46能诱导dNK细胞的细胞毒作用[21];另NKp30可以促进细胞因子的分泌,而NKp44在dNK细胞中具有抑制功能[22]。

日本Fukui教授团队[23]对复发性流产或着床失败妇女子宫内膜NK细胞上NCR和细胞因子的表达进行了研究,主要研究了复发性妊娠丢失(RPL)妇女子宫内膜NCR(NKp46、NKp44和NKp30)的表达和NK细胞的产生,采用流式细胞术检测子宫内膜NK细胞中NCR(NKp46、NKp44和NKp30)的表达,实验收集了34例着床失败妇女和74例对照组的分泌中期子宫内膜的NK细胞,分析孕妇外周血NK细胞NCR的表达状况;结果显示NCR表达及细胞因子产生发生了改变,特别是dNK细胞NKp46表达降低,这提示了复发性流产女性可能存在NK细胞调控异常。但是这项研究也只是探究了几种NCR在RSA患者中的表达情况,并未对之具体的机制进行深入研究。

NKp46又可细分为NKp46dim和NKp46bright。Mai等[24]研究了NKp46受体在决定生殖结果中的作用,通过收集流产妇女的子宫内膜,根据妊娠反应试验结果将子宫内膜分为妊娠组和妊娠失败组,采用多色流式细胞术分析NKp46受体及NK细胞上表达的其他激活或抑制受体及NK细胞产生的细胞内因子;结果发现根据与NK细胞相关的不同荧光强度,NKp46受体在生殖中发挥不同的作用,即NKp46dimNK细胞参与杀死细胞,而NKp46brightNK细胞参与细胞因子的产生;这表明NKp46可能是观察胚胎耐受条件的预测标记,说明该受体在RSA患者发生过程中扮演重要的角色。此项研究并未对NK细胞受体与各自的HLA抗原在RSA患者中的相互作用进行深层次的探讨,但对于我们日后在NK细胞受体与各自的HLA抗原在不明原因RSA(URSA)中的相互作用的研究有一定的启示意义。

三、白细胞免疫球蛋白样受体(leukocyte immunoglobulin receptor,LILR)/免疫球蛋白样转录体(Immunoglobulin-like transcript,ILT)

白细胞免疫球蛋白样受体(LILR)家族的一些成员,也被称为免疫球蛋白样转录体(ILT),其存在于人类胎盘中;白细胞免疫球蛋白样受体家族B成员1(LILRB1,即ILT2)主要在基质细胞上被发现,而白细胞免疫球蛋白样受体家族B成员2(LILRB2,即ILT4)除了基质细胞外,也在平滑肌层的血管周围发现;LILR是一种含有细胞外配体结合免疫球蛋白样结构域和细胞内免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)的I型跨膜糖蛋白,因此被归类为免疫抑制性受体[24]。这些受体类似于KIR,编码在19号染色体(19q14.3)上,且LILR比KIR分布更广。

HLA-G隶属于非经典的HLA-Ⅰ类分子,由 HLA-G基因编码,最初在滋养层细胞被发现。滋养层细胞属于蜕膜侵入细胞,对于母体而言属于同种异体移植物,HLA-G在滋养层细胞中高表达,而HLA-G能够直接抑制NK细胞的杀伤作用,从而保护胎儿细胞免受NK细胞的攻击[25]。HLA-G四聚体的结合被发现是由ILT受体介导的,主要由ILT4介导,ILT2也有一定的贡献,但只有当后者高水平表达时才能介导,ILT2在所有女性dNK细胞中的表达率为20%～25%。ILT2和ILT4均存在于所有蜕膜巨噬细胞上,当ILT2和ILT4与滋养层细胞上的HLA-G结合时,ILT2和ILT4的抑制功能可能会抵消KIR2DL4的激活信号;LILRB1在细胞质区域含有一个酪氨酸的免疫受体开关基序,既可以作为激活受体发挥作用,也可以发挥抑制功能,LILRB1与HLA-G的结合比与经典的HLA-I类分子结合更强,并且HLA-G四聚体比单体形式更有效地诱导LILRB1信号[26]。

近年来,对于母胎界面蜕膜NK细胞表面抑制性受体LILR/ILT与其配体HLA-G在复发性流产中表达及作用的研究少之又少,因而对母胎界面这两者之间关系深层次的探究也可以作为对流产机制探索的新方向[27]。

四、分化决定簇抗原94(Cluster of differentiation 94,CD94)/自然杀伤细胞凝集素样受体亚家族C成员1(NK cell lectin-like receptor subfamily C member-1,NKG2A)

CD94/NKG2A是一种存在于NK细胞和某些T细胞上的受体,由CD94与NKG2分子家族其他成员通过共价键结合而成;这两种分子都是C型凝集素超家族的糖基化成员,CD94/NKG2A受体是HLA-E与特定MHC I类分子信号序列特异性衍生而来的肽分子,信号序列衍生肽的位置在决定HLA-E/肽复合物是否对NK细胞介导的裂解作用具有抗性方面至关重要[28]。针对这一点,美国国家过敏和传染病研究所的Brooks等[29]证实CD94/NKG2A特异性与HLA-E相互作用,并证明这种相互作用依赖于HLA-E与上述衍生肽的结合;此外,通过对CD94/NKG2A+ NK细胞的功能分析,并没有观察到CD94/NKG2A与经典HLA I类分子之间的相互作用,他们还评估了HLA-E相关肽在HLA-E和CD94/NKG2A相互作用中的功能,发现所有I类先导序列多肽均需要与HLA-E结合,并被CD94/NKG2A所识别。可以说HLA-E对CD94/NKG2A的特异性识别是由肽在两个水平上控制的:首先,肽必须稳定HLA-E,促进其在细胞表面表达;另外,HLA-E/肽复合物必须形成CD94/NKG2A的配体[29]。由于NK细胞表面受体主要通过其抑制性受体发挥其细胞毒作用,而CD94/NKG2A作为这样的受体,在体内NK细胞刚开始发育就开始缓慢合成表达,白细胞介素-15可以与其他多种细胞因子可以共同促使祖细胞的分化和增强CD94的表达[29]。

在妊娠过程中,NK细胞对胎盘的形成至关重要,而胎盘是一种能够控制生长中的胎儿所需氧气和营养物质供给的关键器官。dNK细胞不会攻击不相匹配的胎儿及其胎盘,相反,它们帮助局部血管耐受滋养胎儿所需的变化。控制NK细胞功能取决于HLA-I类与抑制性NK细胞受体的相互作用[30];人类首先进化出HLA-E与CD94/NKG2A的相互作用,HLA-E在滋养层细胞表面作为CD94/NKG2A的配体,在CD94/NKG2A抑制受体和HLA的驱动下,子宫dNK细胞促使它们在母胎界面传递这些关键功能,其次才逐渐建立了HLA-A、HLA-B和HLA-C与KIR的多种相互作用[31]。

五、自然杀伤细胞凝集素样受体亚家族B成员2(NK cell lectin-like receptor subfamily B member-2,NKG2D)

NKG2D免疫受体在大多数NK细胞上表达[3],孕早期dNK细胞NKG2D表达降低,在孕中期NKG2D表达增加[32]。NKG2D属于C型凝集素受体家族,其配体为MHCⅠ类同系物MICA和MICB。人应激诱导的MHC Ⅰ类链(MIC)相关蛋白A和B(MICA/B)分子与其同源受体NKG2D的相互作用,是一种免疫逃逸机制;MIC分子是表达于人dNK细胞表面的NK细胞激活受体NKG2D的配体,在体内可以作为细胞应激信号,并触发一系列免疫效应功能;MIC分子能够与NKG2D受体相互识别并交联使得免疫细胞能够对外识别和攻击出现的应激细胞,同时不需要MHC I类表达或抗原识别;据此可以说MIC/NKG2D相互作用是一种有效的免疫监测机制[33-34]。此外,磷脂酰肌醇3-激酶(PIK3)的激活是形成NKG2D免疫突触所必需的;在人体NK细胞上,NKG2D受体的刺激信号可以通过相关的DNAX相关蛋白10(DAP10)适配器介导,NKG2D本身参与刺激NK细胞形成免疫突触,并可以把NKG2D招募到中心突触,在这过程中PIK3的结合位点是必不可少的,且在刺激新号传递前足以将DAP10招募到NK细胞免疫突触的位置[35]。

在女性妊娠期间,母体对胎儿的免疫耐受与胎盘产生的许多免疫抑制因子有密切关系。胎盘源性外泌体作为一种新的免疫调节因子出现在母体免疫耐受中,外泌体是形态明确的膜状纳米大小的囊泡,是由内泌体多囊体(MVB)与质膜融合而成后分泌而来,通过代理传递细胞与细胞之间的接触,在接触过程中,外泌体转移相关分子,使之具有新的特性并且重新编程受体细胞。人胎盘滋养层细胞在整个妊娠过程中能够不断地分泌外泌体,这些外泌体直接在胎盘绒毛膜周围的母体血液中传递,发挥其免疫抑制功能[36-37]。MICA和MICB在妊娠期间由胎盘表达,与合胞滋养细胞的内泌体多囊体分选,通过携带MIC的外泌体释放[38]。

NKG2D在母胎界面针对胎儿的母体免疫反应可能导致反复流产。dNK细胞聚集在母体-胎儿界面,在妊娠期间发挥重要作用;在dNK细胞表面,NKG2D配体通过与相应受体结合激活细胞。在孕妇正常妊娠过程中,合体滋养细胞能够将MICA和MICB分泌到血清中,干扰NKG2D介导的母体对抗胎儿的免疫反应;MICA和MICB水平的降低与dNK细胞上NKG2D水平的增多相关,这个过程可能参与了RSA的发病[39]。Sondes等[40]对RSA中NK细胞受体NKG2D及其配体MICA的基因多态性进行了实验探究,目的是探讨NKG受体基因多态性和MICA基因多态性与RSA的可能关系;此项实验通过等位基因鉴别检测患者和对照组女性NKG2D基因的7个单核苷酸多态性(rs1049174、rs2255336、rs2617160、rs2617161、rs2246809、rs2617169和rs2617170)、NKG2A基因的1个单核苷酸多态性(rs1983526)和MICA基因的1个单核苷酸多态性(MICA129);实验结果也提示NKG2D基因多态性可能影响妇女的妊娠成功率。

根据查阅文献,发现目前在妇产科学中对于NKG2D的研究多集中于卵巢肿瘤及病毒感染机体的免疫层面,而对其在反复自然流产的母胎界面方面的研究少之又少。这也可以为我们对于自然流产的免疫机制相关研究提供新方向。

六、结语

RSA妇女受孕前后NK细胞数量与其细胞膜表面受体的增加是一个重要的临床问题,dNK细胞被认为是胚胎被母亲“排斥”(同种异体免疫流产)的主要细胞群。根据目前已有的对于dNK细胞表面受体的研究,胚胎排斥反应可能是NK细胞同种异体识别系统缺陷的结果。即自然流产患者dNK细胞的毒性与母胎界面各种NK细胞表面受体与其相关配体缺乏表位匹配密切相关,通过受体-配体之间的匹配减弱或缺失,dNK细胞的激活没有被阻断,从而NK细胞的杀伤作用占据主导地位,使其获得杀伤许可,从而无阻碍地破坏滋养层,导致妊娠失败。由于NK细胞相关的免疫识别系统的复杂性使研究人员对于分析其对妊娠结局的影响变得十分棘手,也因此生殖过程中的免疫或免疫遗传机制的研究对我们研究自然流产仍然是一个挑战。增加对KIR/HLA-C复合体、NCR的几种亚型NKp44/NKp46/NKp30、LIR/ILT/HLA-G复合体、CD94/NKG2A复合体和NKG2D的研究,有助于更好地理解母胎界面NK细胞表面免疫受体及其配体相互识别发挥作用的妊娠模型,有助于对不明原因的自然流产患者进行病因分析,甚至于在将来为不明原因的自然流产患者的治疗提供思路,如研究针对相关受体和/或其相关配体的靶向治疗药物等[1]。