北疆地区部分牛场生鲜乳大肠杆菌多位点序列分型分析与耐药性研究

王巧梅　王子杰　操义恒　王晓兰　周霞　吴洁　孙志华　王震　张辉

摘要：目的 為了解生鲜乳中大肠杆菌生物特性及流行特点，本研究采集新疆北疆3个地区6个规模化牛场生鲜乳。方法 采用分离纯化、16S rRNA基因测序和构建系统进化树等方法对大肠杆菌进行分离鉴定；通过PCR 方法对分离株进行多位点序列分型（MLST）和8种耐药基因分析，利用微量肉汤稀释法和结晶紫染色法检测分离株对13种抗生素的耐药性和生物被膜形成能力，小鼠感染试验分析其致病性。结果 共分离鉴定了7株大肠杆菌，分离率38.9%，且具有不同程度致病性；7株大肠杆菌分3个ST型，分别为ST183（57.1%）、ST58（28.6%）、ST49（14.3%）；分离株对头孢曲松钠、头孢吡肟耐药率为85.7%，对阿米卡星、庆大霉素、氧氟沙星耐药率分别为71.4%、42.9%、14.3%；100%分离株携带β-内酰胺类blaTEM，71.4% 菌株携带喹诺酮类aac（6′）-Ib基因，42.8%的菌株携带gyrA，71.4%的菌株携带四环素类Tet（B）基因；KT株具有强生物被膜形成形成能力，SHZ1-1、SHZ2、SHZ3、SHZ4、YL为中等生物被膜形成菌株，SHZ1-2为弱成膜菌株。结论 表明分离于生鲜乳大肠杆菌具有多重耐药特点，并携带多种耐药基因，能形成较强生物被膜，该结果为评估新疆部分地区生鲜乳中大肠杆菌特点和临床用药提供理论依据。

关键词：生鲜乳；大肠杆菌；MLST分型；耐药性；生物被膜

中图分类号：S852.61文献标志码：A文献标识码

Study on multilocus sequence typing analysis and drug resistance of row milk

E. coli in partial scale cattle farm in North Xinjiang

WANG Qiaomei1，WANG  Zijie1，CAO  Yiheng1，WANG  Xiaolan1，ZHOU  Xia1*，WU  Jie2，

SUN  Zhihua1，WANG  Zhen1，ZHANG  Hui1

（1 College of Animal Science and Technology， Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832003，China; 2 Animal Husbandry and Veterinary

Workstation of the Eighth Division of Xinjiang Production and Construction Corps，Shihezi，Xinjiang 832003， China）

Abstract：  Objective In order to understand the characteristics and prevalence of E. coli in raw milk， E. coli in raw milk from 6 large scale cattle farms in 3 regions of northern Xinjiang were identified by conventional separation and purification combined with 16S rRNA sequence analysis. Methods The PCR method was used to analyzed MLST type and the resistance genes of isolates. The resistance phenotypes to 13 antibiotics of isolates were detected by microbroth dilution method. The micro broth dilution method and crystal violet staining method were used to detect the resistance and biofilm formation ability of isolated strains to 13 antibiotics， and the pathogenicity was analyzed through mouse infection test. Conclusion 7 strains of E. coli were isolated， with an isolation rate of 38.9% and with different degrees of pathogenicity. There were 3 ST types in 7 E. coli， namely ST183 （57.1%）， ST58 （28.6%） and ST49 （14.3%）. The resistance rates of isolates to ceftriaxone sodium and cefepime were 85.7% and to amikacin， gentamicin， gentamicin and ofloxacin were 71.4%， 42.9% and 14.3%. 100% of the isolates carried β -lactam blaTEM gene， 71.4% carried quinolone aac（6′）-Ib gene， 42.8% carried gyrA， and 71.4% carried tetracycline Tet（B） gene. KT strain had strong biofilm formation ability. SHZ1-1， SHZ2， SHZ3， SHZ4， YL were medium biofilm forming strains and SHZ1-2 was weak film－forming strain. Results Indicated that E. coli isolated from row milk had multidrug resistance and carried multiple drug resistance genes， which could form strong biofilm. The results provide a theoretical basis for evaluating the characteristics and clinical medication use of E. coli in raw milk in some areas of Xinjiang.

Key words： raw milk;E. coli;MLST typing;drug resistance;biofilm

大肠杆菌是重要的食源性致病菌，也是危害养殖业重要的细菌之一，在兽医临床可引起犊牛腹泻、奶牛子宫内膜炎、食物中毒等疾病［1］。研究表明大肠杆菌广泛存在于环境中，是引起奶牛乳房炎的第二大病原菌，可通过奶牛本身、加工过程、运输过程等途径引起乳品质量下降［2］。

规模养殖场生鲜乳大肠杆菌的存在也是评价其质量的重要标准之一［3-5］。奶牛乳房炎主要采用抗生素治疗，抗生素的广泛长期使用，导致大肠杆菌具有耐药性强、耐药谱广以及复杂的耐药机制的特点［6-7］，同时部分细菌形成的生物被膜也会影响细菌感染能力和耐药特性［8-9］。不同地区大肠杆菌基因组受环境选择压力和随机突变的共同作用具有一定差异性，多位点序列分型MLST可通过序列变化反映菌株之间的进化关系，适用于多地域微生物的流行病学研究［10-11］。

为了解新疆规模化牛场生鲜乳中大肠杆菌的遗传进化特性及耐药性等生物学特性，本文以新疆北疆3个地区6个规模化牛场生鲜乳为研究对象，利用传统方法分结合16S rRNA基因序列分析鉴定大肠杆菌，分析MLST分型、耐药表型与耐药基因等方面特点。

1 材料与方法

1.1 采集样品

生鲜乳样品采样于2022年9月北疆伊犁（1个）、石河子（4个）、奎屯（1个）共6个规模化奶牛场全自动挤奶厅大缸奶样，每牛场采集3个平行样品（5mL·个-1）。

1.2 主要试剂

BHI培养基、LB肉汤购自青岛海博生物有限公司；2×Es Taq PCR MasterMix购自康为世纪生物科技有限公司；DNA Marker购自天根生化科技公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；抗生素购自上海源叶生物科技有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 试验动物

昆明系小鼠，购自新疆医科大学动物中心。

1.4 方法

1.4.1 细菌分离培养与鉴定

无菌采集奶样用PBS溶液稀释放入37 ℃恒温箱培养12～16 h后涂布在BHI培养基上培养12～18 h，挑疑似菌落进行革兰染色镜检，提取疑似细菌DNA，采用PCR扩增16S rRNA基因通用引物进行菌种鉴定，上游引物为5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物5′-GGTTACCTTACGACTT-3′，目的基因片段大小1 500 bp［12］。PCR反应体系20 μL：2×Es Taq PCR MasterMix 10 μL，DNA模板2 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL，ddH2O 6 μL，退火温度56 ℃。将PCR产物送往公司测序，测序结果在NCBI数据库中进行同源性分析。

1.4.2 分离株多位点序列分型（MLST）

根据PubMLST网站（https：//pubmlst.org/）将大肠杆菌7对管家基因合成引物［13］（表1），PCR反应体系同1.4.1，退火温度见表1。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测并送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果提交至PubMLST网站（https：//pubmlst.org/）比对序列得到7个管家基因等位基因序列号可得到分离株相应的ST型。

1.4.3 分离株耐药表型检测

按CLSI微量肉汤稀释法标准［14］，检测分离株对 13种抗菌药的敏感性，选取常见临床药物。头孢类：头孢西丁（FOX）、头孢噻肟（CTX）、头孢曲松钠（CRO）、头孢吡肟（FEP）；β-内酰胺类：阿莫西林（AMX）；酰氨醇类：氟苯尼考（FFC）；喹诺酮类：氧氟沙星（OFLX）、环丙沙星（CIP）、恩诺沙星（ENR）；氨基糖苷类：阿米卡星（AMK）、卡那霉素（KAN）、庆大霉素（GEN）；大环内酯类：阿奇霉素（AZM）。每种抗菌药物用MH肉汤按照倍比稀释法进行11个梯度稀释，药物浓度由高到低分别为128，64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25，0.125 μg·mL-1加入孔中，第12孔作为阳性对照。取100 μL制备的菌液加入至96孔板中，放置37℃培养箱16～20 h后观察结果。计算每种抗菌药的最低抑菌浓度（包括中介菌株），耐药R、中介I、敏感S判定范围标准见表2。

1.4.4 分离株耐药基因检测

以分离株DNA为模板，采取PCR扩增方法，选取大肠杆菌常见8种耐药基因［15］包括：β内酰胺类blaTEM（719 bp）、blaSHV（502 bp）、喹诺酮类aac（6′）-Ib（482 bp）、gyrA（810 bp）磺胺类sul2（793 bp）、sul3（443 bp）、四环素类Tet（A）（210 bp）、Tet（B）（659 bp）进行检测。PCR反应体系同1.4.1，退火温度见表3。

1.4.5 分離株生物被膜检测

采用96孔微量板法，挑取单个菌落接种于新鲜LB肉汤37 ℃培养至生长对数期，吸取200 μL菌液至96孔板37 ℃分别培养6、12、24、36、48、60、72 h，结晶紫染色20 min，95%乙醇脱色25 min，最后酶标仪测定OD600值，用GraphPad prism软件绘制菌株BF生长曲线。以对照孔（未接种细菌）的平均 OD+3×SD 的值（ODc）进行判断，菌株可分为以下几类［12］：无 BF 产生（OD≤ODc），弱 BF 产生（ODc

1.4.6 动物致病性试验

将40只雌雄各半的小鼠随机分为试验组和对照组，每组5只。按0.2 mL·只-1（1.07×1011CFU/mL）剂量腹腔注射菌液，对照组腹腔注射等量灭菌PBS。观察小鼠状态和死亡情况。

1.4.7 病理组织学切片观察

无菌采集死亡小鼠心、肝、脾、肺、肾等组织用4% 福尔马林液固定24 h，制作石蜡切片并进行苏木精-伊红染色（HE染色），观察组织病理变化。

2 结果

2.1 细菌分离培养与鉴定结果

18份样品分离得到7株大肠杆菌，分离率38.9%，图1显示1株来自奎屯某牛场（KT）、1株来自伊犁某牛场（YL）、5株来自石河子某牛场（SHZ1-1、SHZ1-2、SHZ2、SHZ3、SHZ4），SHZ1牛场分离率最高，为66%（2/3）。7株菌PCR产物电泳得到1 500 bp目的条带（图2），通过NCBI数据库不同来源大肠杆菌与本实验分离株同源对比绘制的进化树，SHZ3、YL同源性最相近，SHZ2菌株与猪源大肠杆菌CP046009同源性高达100%（图3）。

2.2 分离株MLST结果

MLST结果表明，7株大肠杆菌分为3种ST型，分别为ST183（57.1%）、ST58（28.6%）、ST49（14.3%），其中SHZ1-1、SHZ2、YL、SHZ1-2为ST183；SHZ3、SHZ4为ST58；KT为ST49。

2.3 分离株耐药表型检测结果

利用微量肉汤稀释法检测7株大肠杆菌对13种抗菌药的MIC，表4为MIC检测结果，其中大肠杆菌对头孢曲松钠、头孢吡肟耐药率为85.7%，对阿米卡星耐药率为71.4%，对庆大霉素耐药率为42.9%，大部分菌株对3种以上抗菌药耐药，均为多重耐药菌。

2.4 耐药基因PCR扩增结果

7株大肠杆菌中β-内酰胺类中blaTEM基因携带率为100%，喹诺酮类aac（6′）-Ib基因携带率71.4%，分别为KT、SHZ1-1、SHZ3、SHZ4、YL；gyrA基因基因携带率为42.8%，分别为KT、SHZ3、SHZ1-2。四环素类Tet（B）基因携带率为71.4%，分别为KT、YL、SHZ2、SHZ3、SHZ1-2，部分检测结果见图4。

未检测到β-内酰胺类中blaSHV基因、磺胺类sul1、sul3基因和四环素类Tet（A）基因。

2.5 大肠杆菌生物被膜的测定

对分离株生物被膜形成能力检测显示分离7株菌株中KT为强成膜菌株。SHZ1-1、SHZ2、SHZ3、SHZ4、YL菌株为中等成膜菌株；SHZ1-2为弱成膜株。将不同时间段测定菌株OD600值绘制BF生长曲线（图5），该图显示分离株0～36h处于上升阶段，6～12h上升迅速，并在24h达到最大值。48h之后迅速下降，60～72h时趋于平缓。

2.6 动物致病性试验

试验组小鼠感染后部分表现为精神萎靡、行为变缓、被毛蓬松、呼吸急促、眼周围肿胀。7株分离株中KT、SHZ1-1、SHZ1-2在24h内小鼠全部死亡；SHZ2、SHZ3、SHZ4、CJ在7 d中小鼠死亡数分别为3、4、2、2；对照组小鼠无死亡。试验组小鼠解剖后表现为脑水肿，肺脏、脾脏、肝脏和心脏有不同程度的肿大和出血，肠黏膜肿胀充气。在发病死亡小鼠肝、肺、脾等脏器中均分离到感染细菌。

2.7 病理组织学切片观察

小鼠感染试验结果：眼观发现肝、脾肿大充血呈暗红色，肝边缘呈黑色；肺肿大明显、伴有出血点。图6显示试验组A图肾小球萎缩变小，肾小管结构组织被破坏；D图为肾组织空白组；B图为肝细胞模糊不清，肝细胞肿大，胞质为淡红色、浑浊，充满炎性细胞；E图为肝组织空白组；C组肺泡管壁充血水肿，肺泡壁结构被破坏，有大量中性粒细胞浸润；F图为肺空白组。

3 讨论

生鲜乳中富含的营养物质及水分为微生物创造了快速繁殖生长的条件，研究显示生鲜乳中常分离到的致病菌有链球菌、葡萄球菌以及大肠杆菌等［16］。付宇［17］、许丹丹等［18］分别从东北地区、新疆石河子地区牛奶中分离鉴定出大肠杆菌，可见生鲜乳中存在大肠杆菌比较普遍。本研究在新疆北疆地区6个规模化奶牛场生鲜乳共分离到17株6种不同的细菌，其中7株为大肠杆菌，KT牛场有5株，SHZ4牛场分离到1株，SHZ1牛场分离2株，且表现出不同程度的致病性。

MLST 序列数据可用于病原分型，也广泛用于细菌分子流行病学以及系统发育的分析。研究显示某一特定的ST型与某些特定疾病相关，例如ST131被认为是肠外致病性大肠杆菌流行序列型［14］。Shafiq［19］等报道在浙江、江苏和上海地区奶牛乳房炎大肠杆菌分离株的优势ST型为ST58。叶菊莲等［20］报道的浙江省不同动物粪便源致病大肠杆菌优势序列型为ST-284，江婉琳［13］等报道的新疆克拉玛依市奶牛粪便分离的多株致病性大肠杆菌ST型ST-154，本研究中分离的大肠杆菌优势序列型ST183（57.1%），SHZ3、SHZ4 ST型为ST58。提示不同地区、不同来源大肠杆菌ST型具有多样性，其优势序列也可表现大肠杆菌特征。

大肠杆菌的耐药现象普遍，不同国家研究者发现存在于生鲜乳大肠杆菌具有明显的耐药性，且多数细菌表现为多重耐药［21-24］。本试验分离株对庆大霉素（42.9%），阿米卡星（71.4%），头孢曲松钠（85.7%），头孢吡肟（85.7%）等抗生素表现为多重耐药的特点与张鹏飞等［3］、吴明光［23］报道的乳房炎牛奶中分离的大肠杆菌耐药性类似，分离株SHZ2与携带抗生素耐药基因人源大肠杆菌同源性为99%。头孢类药物耐药率高于庆大霉素耐药率，提示SHZ牛场可能在临床治疗中使用头孢类抗生素次数更多。本研究分离株100%携带 blaTEM基因，42.8%的菌株携带gyrA基因，对gyrA基因进行测序未发现其突变，因此分离株携带的喹诺酮类耐药基因与耐药表型一致。苑晓萌等［25］在山东地区乳房炎牛奶分离到的大肠杆菌中blaTEM基因携带率为100%，于偉伟等［26］在新疆地区奶牛乳房炎分离的大肠杆菌中有66.1%的菌株携带blaTEM基因。张金宝等［27］研究显示宁夏地区奶牛乳房炎197株大肠杆菌中喹诺酮类耐药基因gyrA检出率为97.46%情况相同，表明本实验分离株具有一定的耐药性，其中分离株对β-内酰胺类的抗生素表现与携带β-内酰胺类blaTEM耐药基因情况一致。生物被膜具有复杂的功能和结构，能够减少药物渗透，是造成病原菌耐药性的重要原因之一［24］。本试验分菌株均能形成明显的生物被膜，其中KT为强成膜株耐药性较强，SHZ1-2为弱成膜株耐药性较弱，表明它们耐药表型也可能受到影响。blaTEM基因是大肠杆菌中常见的β-内酰胺类耐药基因，本研究结果显示来自健康奶牛生鲜乳的大肠杆菌分离株具有携带多种耐药基因、对多种抗生素耐药且具有形成生物被膜的生物学特点，再次提示应更加关注规模化牛场生鲜乳存在的风险因素。

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（责任编辑：编辑唐慧）

收稿日期：2022-11-14

基金项目：新疆生产建设兵团重点领域科技攻关计划项目（2021AB012，2019AB029），新疆生产建设兵团重点领域科技攻关计划项目（）

作者简介：王巧梅（1997—），女，硕士研究生，专业方向为动物群发性疾病防控。

*通信作者：周霞（1968—）， 女， 教授， 从事人畜共患病致病机制与防控方向研究，e－mail： 32123004@qq.com。