COPD患者痰液CCR6、CD83、Th1、Th2表达及临床意义

张洋

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种以长期不可逆的气道受限和持续的呼吸道症状为特征的呼吸系统疾病,全球40岁以上人群中患病率为5%～19%,社会负担重[1-2]。急性加重期COPD(acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease,AECOPD)会加速患者肺功能损害,导致不良预后[3]。探索预测COPD病程的有效标志物,实现疾病监测和及时治疗,有助于提高患者的治疗效果和生活质量。有研究[4]发现,COPD可能为吸烟引起的免疫性疾病,其发病机制与自身免疫系统的失调有关。吸烟者肺组织中存在大量巨噬细胞、中性粒细胞、T淋巴细胞局部浸润,其中T淋巴细胞,特别是CD4+T淋巴细胞,主要通过介导气道炎症或免疫应答,在COPD的免疫调节机制中起重要作用,此过程需要树突状细胞(dendritic cells,DCs)参与。DCs是启动或激活具有强功能活性T细胞的独特抗原提呈细胞(antigen presenting cells,APCs),被认为在免疫反应的启动、调节和维持过程中起着主导作用[5-6]。一项研究[7]发现,CC趋化因子受体6(CC chemokine receptor 6,CCR6)主要表达于未成熟DC(immature DC,imDC),而CD83(cluster of differentiation 83)则主要表达于成熟DC(mature DC,mDC)中。故本研究旨在探讨COPD患者痰液中DCs以及辅助性T细胞(Help T cells,Th)亚群Th1、Th2的变化,从免疫调节机制阐述COPD的发病过程。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2020年8月—2022年11月我院就诊的COPD患者265例,根据疾病状态将135例COPD急性发作期患者纳入AECOPD组,130例COPD稳定期患者纳入COPD稳定期组,选取同期本院健康体检者100例作为正常对照组。纳入标准:(1)符合2018年慢性阻塞性肺疾病全球倡议(global initiative for chronic obstructive lung disease,GOLD)[8]的COPD诊断标准,即肺功能检查显示支气管扩张后第一秒用力呼气容积/用力肺活量(forced expiratory volume in one second/forced vital capacity, FEV1/FVC)<70%和FEV1占预计值<80%;(2)COPD稳定期组咳嗽、咳痰、气喘等症状稳定或轻微;AECOPD组处于病情发作期,或(呼吸困难、痰量和颜色)症状突然恶化,典型症状持续数天,需要更改常规用药方案;(3)COPD患者近1个月内未使用糖皮质激素或抗生素;(4)对照组肺功能检查和各项实验室检查无异常者;(5)可顺利获得各组受试者痰液标本。排除标准:(1)合并其他肺部疾病或伴有气流受限特征疾病,如哮喘、活动性肺结核、支气管扩张、间质性肺病、肺部恶性肿瘤等,或行过肺切除术者;(2)合并慢性炎症性疾病,如类风湿性关节炎、多发性硬化症、结缔组织疾病、炎症性肠病等疾病者;(3)合并心、脑、肝、肾等器官严重功能障碍,其他部位原发恶性肿瘤,血液系统或自身免疫性疾病者;(4)近1个月内接受过全身性类固醇或抗生素等抗感染治疗者。收集受试者性别、年龄、病程、体质量指数、吸烟史等资料并进行分析,3组间年龄、性别等一般资料比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。见表1。本研究由我院医学伦理委员会批准(批号:KS-2023-05-10),所有患者均签署知情同意书。

表1 3组受试者一般资料比较

1.2 方法

1.2.1 痰液样本采集 正常对照组和所有COPD患者在入院后,使用抗生素及激素治疗前收集晨起痰液标本2 mL,吸入200 μg沙丁胺醇和3%高渗盐水诱导痰排出。将痰标本排入无菌杯后,低倍显微镜下观察,上皮细胞<10个和白细胞>25个判断为合格。将合格样品与1×0.1%二硫苏糖醇混匀后在37 ℃下孵育30 min,加入等体积无菌生理盐水混匀,晃动5 min,然后4 ℃下以12 000 r/min离心10 min,吸取上清液在-80 ℃储存。

1.2.2 痰液样本中CD83和CCR6水平检测 采用流式细胞术检测痰液中CD83和CCR6表达水平,将痰上清液加入10 μL小鼠抗人CD83抗体(美国eBioscience公司)和小鼠抗人CCR6抗体(美国eBioscience公司)共处理20 min。用0.1% NaN3溶液和1%胎牛血清悬浮细胞。BD FACSCelestaTM流式细胞仪(美国BD公司)检测CD83、CCR6阳性细胞百分比,计算CD83/CCR6比值。

1.2.3 痰液样本中Th1、Th2相关细胞因子水平检测 采用酶联免疫吸附试验(enzyme- linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒检测痰样本上清液中Th1 [干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)]和Th2 [白细胞介素(interleukin,IL)-4、IL-6] 相关细胞因子水平,试剂盒均购自上海茂元科技有限公司。

1.2.4 肺功能测定 COPD患者于治疗前行肺功能检测,正常对照组于体检时进行肺功能检测。受试者取坐位,待呼吸平稳时,使最大可能吸气后迅速且最大力呼出,通过肺功能仪(HI-101,日本CHEST捷斯特)获取FEV1、FEV1/FVC和FEV1% pred,评估患者肺功能。根据GOLD报告进行肺功能分级[8],Ⅰ级:气流受限轻度,FEV1%Pred≥80%;Ⅱ级:气流受限中度,FEV1% 50%～79%;Ⅲ级:气流受限重度,FEV1% 30%～49%;Ⅳ级:气流受限极重度,FEV1% <30%。

1.2.5 COPD稳定期组COPD评估测试(COPD assessment test,CAT)评分[9]采用CAT评分评估COPD稳定期患者日常活动水平,量表包括咳嗽、咳痰、胸闷、呼吸困难、活动受限、离家信心、睡眠和精力情况8个项目,每个项目分数从0～5分(无到极严重),CAT总分从0～40分(0～10:轻度影响;11～20分:中度影响;21～30分:重度影响;31～40分:极重度影响)。CAT的最小临床重要差异为2分。

1.2.6 COPD稳定期组改良版英国医学研究委员会呼吸问卷(modified British medical research council,mMRC)分级[10]采用mMRC分级评估COPD稳定期患者呼吸困难程度。mMRC分级0级:患者在剧烈活动中出现呼吸困难;1级:平地快步行走/爬缓坡中出现呼吸困难;2级:患者平地快步行走/爬缓坡较同龄人缓慢,需要休息;3级:患者平地行走100米或数分钟后需停下喘气;4级:患者呼吸困难无法离家/穿脱衣服时出现呼吸困难。mMRC分级≥2级被认为是严重呼吸困难。

1.3 观察指标 观察比较3组痰液样本中CD83、CCR6及Th1、Th2相关细胞因子水平变化,分析其与COPD稳定期患者肺功能、CAT评分及mMRC分级的关系。

2 结果

2.1 3组受试者一般资料比较 3组受试者间年龄、性别、吸烟史、体质量指数、病程及近1个月内主要用药史比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2 3组受试者痰液CD83、CCR6及Th1、Th2相关细胞因子表达水平比较 AECOPD组、COPD稳定期组、正常对照组痰液中CD83/CCR6比值依次升高,IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6水平依次降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3组痰样本中CD83、CCR6表达及Th1、Th2相关细胞因子水平比较

2.3 不同肺功能分级的COPD稳定期患者痰CD83、CCR6及Th1、Th2相关细胞因子表达水平比较 随着COPD稳定期患者GOLD肺功能分级逐渐升高,痰液中CD83/CCR6水平逐渐降低,IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6水平则逐渐升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 不同肺功能分级的COPD稳定期患者痰CD83、CCR6表达及Th1、Th2相关细胞因子水平比较

2.4 不同CAT评分的COPD稳定期患者痰CD83、CCR6表达及Th1、Th2相关细胞因子水平比较 随CAT评分逐渐增加,患者痰液中CD83、CD83/CCR6水平逐渐降低, TNF-α、IL-4、IL-6水平则逐渐升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。轻度影响组CCR6、IFN-γ显著低于中度、重度、极重度影响组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 不同CAT评分的COPD稳定期患者痰样本中CD83、CCR6表达及Th1、Th2相关细胞因子水平比较

2.5 不同mMRC分级的COPD稳定期患者痰CD83、CCR6表达及Th1、Th2相关细胞因子水平比较 按mMRC分级将患者分为mMRC分级<2级亚组和mMRC分级≥2级亚组,mMRC分级≥2级亚组患者的CD83、CD83/CCR6比值低于mMRC分级<2级亚组,而IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6水平则显著高于mMR<2级亚组,差异有统计学意义(P<0.05)。2组间CCR6水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 不同mMRC分级的COPD稳定期患者痰CD83、CCR6表达及Th1、Th2相关细胞因子水平比较

3 讨论

AECOPD是COPD发展的自然病程,患者症状加重,肺功能恶化,生活质量下降,是未来发病率和死亡率增加的潜在危险因素。GOLD指出,预防和治疗急性加重是COPD管理的关键目标之一[8,11]。目前已证实COPD与气道和肺实质的慢性炎症有关,急性加重时增加与全身性炎症有关[12]。众所周知,COPD炎症应答过程需要启动T细胞介导的免疫应答,DCs是激活T细胞的最重要的免疫细胞。COPD动物模型和COPD患者外周血中DC显著降低,但结论存在争议[13]。本研究中,COPD患者痰样本中CD83/CCR6比值普遍降低,尤其是AECOPD患者降低更明显。笔者推测可能与DCs的不成熟状态有关,且肺组织中不成熟DCs浸润增多可能是导致疾病急性发作的重要原因之一。这一结论与Su等[14]研究结果一致,该研究结果表明COPD患者中mDCs降低,且随着COPD的进展,DCs成熟度受到进一步抑制。

此外,有研究[15]提出,T淋巴细胞与DCs的相互作用是COPD免疫调节机制中重要的环节。活化的CD4+T淋巴细胞可分化为Th1及Th2细胞,Th1细胞主要分泌促炎相关细胞因子,如IL-2、IL-12、TNF-α、IFN-γ等,Th2则为分泌抗炎相关细胞因子,如IL-4、IL-5、IL-6等。Th1与Th2可以相互制衡从而维持机体的免疫稳态,当Th1、Th2细胞发生异常分化、平衡打破时就会引发免疫功能障碍。Wei等[16]对AECOPD及稳定期COPD患者Th1/Th2细胞及其相关细胞因子表达研究显示,AECOPD患者IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-17的水平高于COPD稳定期或正常对照组,证实了COPD患者的急性发作与CD4+T淋巴细胞亚群的失衡相关,且该变化是由Th1/Th2失衡引起的。本研究结果显示,COPD患者痰样本中Th1相关细胞因子(IFN-γ、TNF-α)、Th2相关细胞因子(IL-4、IL-6)水平均显著升高,且AECOPD组患者各指标水平变化最为明显,与Wei等[16]学者的研究结论相符。本研究结果发现,Th1及Th2相关细胞因子水平的升高,还与稳定期COPD患者肺功能下降、呼吸困难程度及日常活动水平的影响加重相关。

肺功能检查可反映COPD患者的疾病进展和肺功能水平,也可有效评估患者的生活质量[17]。但由于COPD是一种全身性疾病,病情受多种因素影响,单一肺功能检测无法真实反映患者病情状况,因此临床在评估COPD病情程度时,需要综合其他指标共同评价。mMRC量表在评估COPD患者呼吸困难的严重程度方面具有重要价值,CAT评分有助于监测COPD加重后的恢复情况[18]。GOLD肺功能分级评估结合CAT评分和mMRC量表可能更有效地预测COPD的临床病程。既往研究[19]证实,肺组织中DCs成熟标记物表达的增加与COPD的严重程度相关,且在COPD患者的小气道和肺泡中DCs成熟度显著降低。Lourenco等[20]研究发现,Th1、Th2及Th17细胞的细胞因子水平与疾病严重程度相关,其表达水平可作为判断COPD严重程度的指标。在本研究中,稳定期COPD患者痰液中CD83、CCR6及Th1、Th2相关细胞因子与肺功能分级、CAT评分及mMRC量表有关,痰液中CD83/CCR6比值随着稳定期COPD患者GOLD肺功能分级和CAT评分增加逐渐降低,而IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6水平逐渐升高;mMRC分级≥2级患者痰液CD83/CCR6比值显著降低,IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6水平则显著升高。表明随着COPD疾病严重程度的加重,患者痰液中的DCs的成熟度、Th细胞相关因子均会发生明显变化。

综上所述,稳定期COPD患者和AECOPD患者痰液中CD83/CCR6比值降低,Th1和Th2相关细胞因子水平升高,且这些指标可反映COPD患者肺功能状态、呼吸困难程度及生活质量,提示其有作为预测COPD急性加重风险和病情程度的生物标志物的潜力,有助于更精确和有效的疾病管理。但本研究未考虑治疗前后指标的动态变化,是局限性之一,后续研究需进一步关注治疗对CCR6、CD83和Th1、Th2相关细胞因子的影响及在COPD发病中的潜在病理机制。