一例牛焦虫病急性死亡病例的检测

余世祥，班福泽，郭红瑞，吴绍伟，邓成松，鲁金强，张松梅，张晓梅，柴 俊，张以芳*

(1.德宏州尚善品味农业有限公司 679200；2.云南农业大学动物医学院 650201)

牛焦虫病又叫做巴贝斯虫病或牛梨形虫病，是一种流行性强且比较严重的寄生虫病之一，这种疾病是牛巴贝斯虫、环形泰勒虫寄生于牛红细胞中而引起的血液原虫病[1]，它依靠蜱虫进行传播。临床症状表现为高热稽留40～42 ℃、食欲减退、心跳加快、反刍缓慢、黄疸、贫血、生长发育不良、身体消瘦、排血红蛋白尿等症状[2]，一般情况下潜伏周期为14～20 d。同时蜱虫在6～8月大量繁殖，所以发病高峰期也集中在这段时间，且大多呈散发或地方性流行为主[3]。焦虫感染动物很多，但主要危害牛、羊[4]。该牛临床检查时表现为心跳加快、高热、呼吸急促、食欲减退，治疗时用安乃近、头孢等退烧药治疗无效后死亡，对其进行病理解剖，发现牛心脏被大量脂肪包裹，血液稀薄，其余没有发现明显病变，初步确诊为先天性护心脂肪异常（脂肪心），但因血液稀薄，用安乃近、头孢等退烧药无效，疑似感染焦虫病，为此我们进行血涂片镜检观察和PCR 检测，具体检测方法如下。

1 材料及方法

1.1 样品

云南德宏地区某牛场疑似患焦虫病急性病死牛抗凝全血。

1.2 主要试剂

瑞氏染液；核酸染料（溴化乙啶）购自赛百盛公司；50xTAE 缓 冲 液 购 自BIOWEST；DL2000 DNA Maker、RNasefree Water 均购自宝生物工程（大连）有限公司；2×EasyTaq○R PCR SuperMix(+dye)、血液/细胞基因组DNA 提取试剂盒均购自北京全式金生物科技有限公司。

1.3 实验器械

电子天平（YP3002）购自BIO-RAD 公司；超净工作台购自苏州安泰空气技术有限公司；移液枪（15599618）购自BIO-RAD 公司；电热恒温水浴锅购自上海比朗仪器制造有限公司；漩涡振荡器购自江苏其林贝尔仪器制造有限公司；电泳仪（BG-power 600）购自北京百晶科技公司；PCR 仪购自BIO-RAD 公司；迷你离心机（LX-200）购自其林贝尔仪器制造有限公司；4℃离心机（1—14K 145870）购自常州电器国华有限公司；凝胶成像系统（GelDoc-lt2-310）购自美国UVP 公司；立式压力蒸汽灭菌器（YXQ-LS-50SII）购自Thermo Hybaid 公司；数码生物显微镜（BM2100）购自江南永新光学有限公司。

1.4 牛血液血涂片的制备

取一载玻片放在平坦的实验桌上，吸取一小滴血液于载玻片中央，右手持推片缓慢靠近血滴，停留片刻使血液向两边展开，充分展开后调整推片与载玻片之间的角度，使其成呈45°角，用相同的速度将血液推成血涂片，且血涂片厚薄度要适合，血涂片制好后将其彻底晾干，血液完全晾干后，用瑞氏染液进行染色，用显微镜进行观察有没有虫体，如果有则进行下一步检测，观察结果如图1 所示。

图1 焦虫血涂片

1.5 引物的设计

根据GeneBank 中登录的基因序列，应用Primer6软件设计引物，引物由北京擎科生物科技有限公司合成，正向引物：CTATGCCGACTAGGGATTGG；反向引物：TCCTTACGCTGTCTGGACCT。目的条带大小为200bp。

1.6 基因组的提取

第一，取200 μL 抗凝血于1.5 mL 离心管中；

第二，加入20 μL 蛋白酶K 溶液，充分混匀，然后加入200 μL 结合液CB，充分混匀，70℃水浴加热10 min。

第三，冷却至室温加入100μL 异丙醇，充分混匀。

第四，取一吸附柱AC 放入收集管中，将上述混合物倒入其中，13000rpm 离心1 min，去掉收集管中的液体。

第五，加入500 μL 抑制物去除液IR，13000 rpm离心30 sec，去除废液。

第六，加入600 μL 漂洗液WB，13000 rpm 离心30 s，弃除废液，重复一次。

第七，将吸附柱AC 放入新的收集管中，13000 rpm离心2 min。

第八，取出吸附柱AC，放入一个新的离心管中，加100 μL 洗脱缓冲液EB 于吸附膜中间，静置5 min，13000 rpm 离心1 min。

第九，提取产物放于-20℃保存，如需长期保存则应放置-80℃冰箱中保存。

1.7 PCR 扩增

将PCR 管进行高压灭菌，向其中分别加入2×EasyTaq○R PCR SuperMix(+dye)12.5 μL，焦虫上游引物和下游引物各1 μL，模板DNA1μL，由于整个体系需保持25μL，所以需要加入双蒸水9.5μL，充分混匀，然后进行扩增。PCR 扩增条件：预变性94℃2 min，变性94℃30 s，退火56℃30 s，延伸72℃30 s，循环35 次，循环结束后72℃孵育7 min，然后保存在4℃条件下。

1.8 琼脂糖凝胶制备

按每10 mL 1×TAE 溶液，加1.0 g 琼脂糖粉的比例称量1×TAE 电泳液与琼脂糖粉，加热至完全溶解。

1.9 琼脂糖凝胶电泳鉴定

琼脂糖凝胶冷却至30℃左右时加入核酸染料，然后倒置至胶槽中等待凝固，凝固后取出胶板将胶板放入电泳槽中，添加1xTAE 电泳缓冲液至没过胶板为止，取7 μL DL2000 DNA Marker 加入第一个上样孔中，在另一上样孔中加入7 μL 水作为阴性对照，然后取2 μL loading buffer 与5 μL 待测样品充分混匀，加入另一上样孔中。加样时要注意不要把凝胶底部刺穿。加样完毕后，接通电源，调节电压60～100 V，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm 处时（一般30～60 min），关闭电源，取出胶板，使用凝胶成像系统在紫外灯下观察，并拍照保留，结果如图2 所示。

图2 引物扩增结果

1.10 检测阳性样品PCR 产物目的片段胶回收

第一，在紫外灯下快速切下凝胶中目的条带，放入离心管，称重。凝胶重100 mg 视为100 μL。

第二，加入3 倍凝胶体积GSB 溶液，55℃水浴10 min 融化凝胶块，每3 min 摇晃，直至凝胶融化。

第三，将融化的凝胶溶液吸入离心柱，静置2 min。12000 r 离心1 min，弃滤液。

第四，在离心柱中加入700 μL WB 溶液，12000 r离心1 min，弃滤液。

第五，重复步骤四。

第六，12000 r 离心2 min，除剩余WB 溶液。

第七，将离心柱置于新离心管中，在柱中心加入40 μL EB 溶液（于60℃水浴预热），静置5 min，12000r 离心2 min，洗脱DNA。

第八，产物-20℃保存。

1.11 DNA 测序及同源性分析

将回收产物送至北京擎科生物科技有限公司进行测序，将测序结果在NCBI 数据库中进行比对分析。

2 结果

2.1 血涂片瑞氏染色结果

血涂片瑞氏染色观察，可见红细胞内有环形、梨形、椭圆形的典型虫体，结果如图1 所示。

2.2 PCR 检测结果

PCR 核酸鉴定检测出与目的条带相符条带，如图2所示。

2.3 PCR 产物序列及序列比对结果

PCR 产物测序结果如下：

TCTATGCCGACCTGGGATTGGAGGTCGTCAGTTT TTACGACTCCTTCAGCACCTTGAGA-AAATCAAAGTC TTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAA CTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTG GAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACT CACCAGGTCCAGACAGCGTAAGGAAA

将该序列在NCBI 数据库中进行BLAST 比对，结果显示该基因与吕氏泰勒虫同源性为98.97%，下图3所示。

图3 序列比对结果部分截图

综合以上，形态染色、PCR 扩增及基因同源性比对结果，确诊该发病牛的主要致病原因是血液吕氏泰勒虫感染。

3 讨论

蜱虫也叫壁虱、扁虱、狗豆子、草爬虫，大多生活在森林、灌木丛、草地草原、半荒漠地带、鸟巢中，同时也常寄生于一些动物身上[5]。焦虫病由蜱传播，又称蜱热。云南省德宏州是焦虫病的常发地区，发病季节为每年6～10 月份。

本次检查时间为11 月，气温逐渐降低，已过蜱虫大量繁殖期，本不应感染焦虫病，为此我做出如下分析：第一，焦虫病是由于携带病原的蜱虫叮咬感染，德宏州属于亚热带湿润季风气候，冬无严寒，夏无酷暑，雨量充沛，干湿分明，气候温暖，年温差小，牛场所在地又靠近森林，且牛圈旁有一定数量的草地，适合蜱虫生活，所以11 月份偶尔有蜱虫活动，导致牛只患焦虫病；第二，蜱虫所携带的焦虫为血液寄生虫，可造成血液携氧气能力下降，氧饱和度降低，加上这段时间处于换季，气温逐渐降低，牛只抵抗力相对减弱，在各种因素诱导下造成牛只心脏病发病，从而导致牛只死亡；第三，牛场养殖模式为圈养，时常有外来牛只在牛场周边活动，导致消毒灭蜱工作进行不彻底，导致有牛只感染焦虫病。

家畜养殖过程中寄生虫病时常发生，给人们造成较大经济损失，引起了人们高度重视。同时焦虫病又是流行性强且比较严重的寄生虫病之一。所以在养殖过程中我们要做到以下几点：第一，养殖过程中“以防为主，防治结合”搞好灭蜱工作，阻断传播媒介，根据蜱虫生活习性，在蜱虫大量繁殖季节每星期用一定比例敌杀死油乳剂对牛体、圈舍及周边环境进行灭蜱和清除虫卵[6]，也可用烧牛粪、堆粪发酵等方法处理蜱虫滋生环境；第二，加强免疫。引进牛只时先隔离观察，确认健康后才能混养，严禁病牛入场，饲养过程中定期对牛进行检疫；第三，加强药物预防。在焦虫病高发季节，对牛合理使用中药或西药进行预防[7]；第四，加强疫苗预防。每年3～4 月份对牛进行牛焦虫疫苗免疫接种；第五，加强饲养管理。做好牛圈环境卫生清理，定期对饲养环境进行消毒，杀灭蚊、蝇、蜱等寄生虫的中间宿主[8]；加强牛场周边管理，禁止其他动物靠近牛场周边。第六，对于放牧牛群，放牧区可以采取牧场轮换和牧场隔离的方法，切断蜱虫吸血来源，来年再进行放牧，这种也是预防焦虫病的有效方法之一，还可以在放牧前对牧区进行药物杀蜱，以防发病。