GC-MS/MS法测定复方二甲双胍格列吡嗪胶囊中N-亚硝基二甲胺与N-亚硝基二乙胺

岳青阳，张耀文，徐万魁*（1.辽宁省检验检测认证中心，沈阳 110036；2.辽宁省药品检验检测院/国家药品监督管理局化学药品质量研究与评价重点实验室，沈阳 110036）

基因毒性杂质是指能够直接或间接损伤细胞DNA，产生基因突变或体内诱变，具有致癌可能或者倾向的一类物质，对DNA的损害包括染色体断裂、DNA重组及复制过程中共价键的插入和修饰，也包括在细胞水平产生基因毒性物质而产生的突变[1-2]，如磺酸酯类、N-亚硝胺类、卤代烷烃类和肼类等，其中N-亚硝胺类基因毒性杂质是公认的强毒性的化合物之一。N-亚硝基二甲胺（NDMA）及N-亚硝基二乙胺（NDEA）均为常见的N-亚硝胺类化合物，不仅属于2A类致癌物质，而且属于三大“关注队列”的基因毒性杂质，在 ICH M7 指南中明确该类化合物具有较高致癌性[3-5]。

目前，我国高血糖发病率持续增长，其中2型糖尿病占糖尿病人群的近90%，二甲双胍产品作为治疗2型糖尿病的一线药物，有着稳定的市场需求[6]。糖尿病患者需要终身服药，且服用的剂量大、时间长，因此需要更加严格地控制杂质水平。2019年12月，FDA宣布从降糖药物盐酸二甲双胍制剂中检出杂质NDMA，随后我国药品监督管理部门也陆续开展了二甲双胍制剂中NDMA的监测工作[7-9]。复方二甲双胍格列吡嗪胶囊为盐酸二甲双胍与格列吡嗪的复方制剂，临床上用于改善2型糖尿病患者的血糖控制，由临床数据显示，使用该复方制剂比单独使用二甲双胍效果更佳，且患者依从性、耐受性好，因此该制剂在临床上使用较为广泛[10-11]。目前复方二甲双胍格列吡嗪胶囊在国内尚属独家品种，并未对其中的亚硝胺类杂质进行控制，国内未见复方二甲双胍格列吡嗪胶囊中NDMA和NDEA检测的有关文献。本文采用GC-MS/MS法同时测定盐酸二甲双胍格列吡嗪胶囊中的NDMA和NDEA，结果准确可靠，可为其质量控制提供依据。

1 材料

1.1 仪器

气相色谱-质谱联用仪（GC2030气相色谱仪，TQ8050NX质谱检测器，日本岛津公司）。XP205电子天平（美国METTLER TOLEDO公司，精度0.000 01 g）。

1.2 试药

NDMA对照品（纯度为99.5%，批号：510166-202104）、NDEA对照品（纯度为100.0%，批号：510168-202103）（中国食品药品检定研究院）。二氯甲烷（色谱纯，批号：22085094，美国Fisher公司）；盐酸（分析纯，批号：20210220，国药集团化学试剂有限公司）；氦气（纯度＞99.99%）。8批复方二甲双胍格列吡嗪胶囊均为辽宁修和药业有限公司生产。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Agilent VF-WAXms毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.50 μm）。柱温为程序升温：初始温度为40℃，维持0.5 min后，以20℃·min-1的速率升至200℃，再以60℃·min-1的速率升至240℃，维持5 min；进样口温度为250℃；进样量：1 μL；载气为氦气，流速1.2 mL·min-1；电离方式：电子轰击源（EI）；离子源温度：230℃；采集模式：MRM；离子源电压0.99 kV。NDMA的定量离子对74/44，碰撞能量为6 V，定性离子对为74/42，碰撞能量为21 V；NDEA的定量离子对为102/85，碰撞能量为6 V，定性离子对为102/55，碰撞能量为21 V。

2.2 对照品储备液的制备

分别取NDMA与NDEA对照品各约10 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，用二氯甲烷溶解并稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品储备液。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取本品内容物适量（约相当于盐酸二甲双胍500 mg），置50 mL离心管中，加1 mol·mL-1盐酸溶液10 mL，涡旋1 min，再以350 次·min-1的频率振摇10 min，精密加入二氯甲烷10 mL，以1000 r·min-1涡旋1 min，继续振摇10 min，然后以4000 r·min-1离心10 min，小心抽取下层二氯甲烷层过滤，以0.45 μm滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.4 系统适用性试验

精密量取混合对照品储备液适量，用二氯甲烷稀释至质量浓度为40 ng·mL-1的溶液作为系统适用性溶液，以二氯甲烷作为空白溶液，取系统适用性溶液和空白溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，见图1。结果表明，溶剂不干扰NDMA和NDEA的测定。

图1 二甲双胍格列吡嗪胶囊代表性色谱图Fig 1 Representative chromatogram of compound metformin hydrochloride and glipizide capsules

2.5 线性关系考察

精密量取混合对照品储备液适量，用二氯甲烷逐步稀释至0.2、0.5、1、2、5、10、20、40 ng·mL-1，进样测定，结果见表1。各组分在0.1966～39.32 ng·mL-1及0.1870～37.41 ng·mL-1内与峰面积线性关系良好。

表1 NDMA和NDEA线性关系、检测限及定量限Tab 1 Linearity，detection limit，and quantitation limit of NDMA and NDEA

2.6 检测限和定量限

精密量取对照品储备液，用二氯甲烷逐步稀释，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，以信噪比（S/N）≈3时的浓度，为其检测限（LOD），S/N≈10时的浓度，为其定量限（LOQ），结果见表1。

2.7 精密度

取0.5 ng·mL-1对照品线性溶液，连续进样6次，记录色谱图，NDMA的RSD为1.8%（n＝6），NDEA的RSD为3.2%（n＝6），表明仪器的精密度良好。

2.8 加样回收试验

取同一批样品内容物9份，分别精密加入20、25、30 ng·mL-1对照品溶液1 mL，各3份，按“2.3”项下方法进行处理后进样测定，计算各浓度的回收率。结果NDMA和NDEA加样回收率在82.3%～85.4%，RSD在2.6%～3.9%，结果表明该方法准确可靠。

2.9 重复性

取样品4粒内容物，精密加入25 ng·mL-1对照品溶液1 mL，按“2.3”项下方法进行处理后进样测定，同法配制6份，记录色谱图。结果NDMA和NDEA峰面积的RSD分别为2.6%和4.1%，表明重复性良好（n＝6）。

2.10 稳定性

取重复性样品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别在0、2、4、8、12 h进样测定。结果表明，以二氯甲烷为溶剂，NDMA和NDEA在12 h内稳定，峰面积的RSD分别为2.4%和4.9%。

2.11 测定结果

取本品适量，按“2.3”项下方法处理后进样测定，将测定结果代入标准曲线计算NDMA和NDEA含量。结果表明，8批复方二甲双胍格列吡嗪胶囊中均未检出NDMA和NDEA。

3 讨论

3.1 检测方法的选择

目前，N-亚硝胺杂质的定量分析方法主要有GC-MS法、GC-MS/MS法、LC-MS/MS法、LCHRMS法等[12-15]，本文采用GC-MS/MS方法，检测专属性强，灵敏度高，操作简便。

3.2 质谱条件的选择

制备10 μg·mL-1的混合对照品溶液，使用全扫描模式对混合对照品溶液进行m/z40～200内的扫描，使用谱库比对确定NDMA和NDEA的色谱峰，根据相对强度选择前体离子，NDMA和NDEA均选择分子离子作为前体离子。再通过产物离子扫描对碰撞能量及二级碎片离子进行优化，选择响应最高的产物离子，作为定性离子和定量离子。

3.3 供试品提取方法的选择

中国食品药品检定研究院颁布的盐酸二甲双胍中N-亚硝基二甲胺推荐检测方法中盐酸二甲双胍不同制剂采用了不同提取溶剂，本研究分别考察了二氯甲烷及盐酸加二氯甲烷两种提取方式，并考察了涡旋时间及振摇时间等因素。通过NDMA及NDEA的回收率对比试验，发现采用二氯甲烷提取，基质效应较大，辅料干扰测定，而采用1 mol·mL-1盐酸加二氯甲烷作为提取溶剂时，辅料不干扰测定，且提取时涡旋1 min，振摇10 min，提取效果最佳。

3.4 假阳性结果的处理

在样品测定中发现在与NDMA对照品相同保留时间处出现色谱峰，且该色谱峰的定量与定性离子对均与对照品相同，但离子强度比与对照品相差较大，出现了假阳性现象。经优化质谱条件，将分辨率由“high”优化为“unit”后，假阳性现象消失。

根据美国致癌性数据库（CPDB）中化合物的TD50值，NDMA和NDEA按每日注射最大日暴露量（PDE）96 ng·d-1和26.5 ng·d-1计，按照二甲双胍每日最大剂量2000 mg，NDMA和NDEA对应的分析评价阈值（AET）为48 ng·g-1和13.25 ng·g-1。通过对8批复方二甲双胍格列吡嗪胶囊中的NDMA和NDEA杂质进行检测，结果显示两种杂质含量均小于其AET。