基于理化性质和抗胃溃疡作用优化煅牡蛎的炮制工艺

张凤婷，钤莉妍，包丽媛，齐晓丹，米硕，李文汇，赵颖，贺文慧，王颖莉，谢磊磊，张丽丽，宋亮亮，杜红*（.北京中医药大学中药学院，北京 0488；.东阿阿胶股份有限公司山东省胶类中药技术创新中心，山东 聊城 500；.山西中医药大学，太原 0069）

牡蛎是牡蛎科动物长牡蛎OstreagigasThunberg、大连湾牡蛎OstreatalienwhanensisCrosse或近江牡蛎OstrearivularisGould的贝壳[1]。生品具有重镇安神、平肝潜阳的功效，其质地坚硬，临床常使用其煅制品。煅品具有收敛固涩、制酸止痛的功效，临床常用于胃溃疡的治疗。

关于煅牡蛎的炮制工艺，《中国药典》2020年版中要求“煅至红透，质地酥脆时取出”，未明确煅制温度与时间要求。以研究的温度范围一般是片段式，并不全面，且多以表观性状、孔道大小，结合钙离子溶出作为主要考察因素[2-5]。然而，牡蛎生、煅品作用不同，碳酸钙作为牡蛎的主要成分，仅以其含量的高低难以解释生熟异用的特点。因此，本研究系统考察100～900℃煅制1～4 h的煅制品的理化性质，结合反映煅牡蛎制酸止痛作用的药理学指标，综合对其炮制工艺进行优选。

1 材料

1.1 试药与仪器

牡蛎购自安徽亳州药材市场，经北京中医药大学中药鉴定系王晶娟教授鉴定为牡蛎科大连湾牡蛎的贝壳。饮片经检查符合《中国药典》2020年版要求。溴化钾（批号：20210427，天津福晨化学厂），碳酸钙（批号：20171226，北京化工厂），氧化钙（批号：20220418，天津福晨化学厂），硫糖铝咀嚼片（批号：210103，上海华源安徽仁济堂制药有限公司）。一氧化氮检测试剂盒（BN27106，北京百瑞极生物科技有限公司），超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）测定试剂盒（批号分别为20221011、20221008，南京建成），PGE2、IL-4、TNF-αELISA测定试剂盒（批号分别为202203、202202、202202，科特生物）。

SX2-2.5-10A箱式电阻炉（绍兴市上虞道墟科析仪器厂），PerkinElmer Spectrum One傅里叶变换红外光谱仪（德国Bruker），TMS-Touch物性分析仪（北京盈盛恒泰科技有限责任公司），X 射线衍射仪（粉末 D/max 2500型，日本理学公司），ASAP 2460 Version 2.01比表面积和孔径分析仪（Micromeritics）。

1.2 动物

SPF级雄性SD大鼠（180～220 g）[斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证编号SCXK（京）2019-0010]。给予普通维持饲料和自由饮水，维持室温20～25℃，相对湿度60%～70%，灯照周期12 h。动物伦理委员会批件号：BUCM-4-2023022104-1020。

2 方法和结果

2.1 煅牡蛎样品制备

称取100 g净制后的牡蛎，置于马弗炉中，分别设定温度为100、200、300、400、500、600、700、800、900℃，各煅制1、2、3、4 h，得到不同条件下煅牡蛎样品36份。粉碎过100目筛备用。

2.2 理化性质测定

2.2.1 红外分析 取“2.1”项下样品粉末，采用溴化钾压片法压制成透明薄片进行检测[6]。检测条件为DTGS检测器，4 cm-1分辨率，扫描光谱范围 4000～400 cm-1，16次扫描累加。所得光谱数据运用OMNIC 进行基线校正、自动平滑等优化处理。结果如图1所示。

图1 牡蛎及不同煅制品红外光谱Fig 1 Infrared spectra of oysters and different calcined products

3530 cm-1左右是O-H/N-H的吸收峰，属于有机基团[7]；3000～2800 cm-1附近是有机质C-H伸缩振动的吸收峰，2520 cm-1附近也属于有机质，1760 cm-1、1500cm-1、1000～600cm-1为CO32-的特征吸收峰；3640cm-1附近小吸收峰是氧化钙吸收水生成Ca（OH）2形成的[8]；2330 cm-1附近是由于高温分解生成的CO2吸附于多孔的氧化钙中所致[9]。

结果显示，600℃煅4 h、700℃煅3 h、800℃煅2 h、900℃煅1 h的煅牡蛎中碳酸钙已开始部分分解，成分中既有碳酸钙也有氧化钙。800℃煅3 h、900℃煅2 h的煅牡蛎中碳酸钙已全部分解，成分组成只有氧化钙。这表明，在600～900℃煅制时，煅制温度和煅制时间对煅牡蛎中碳酸钙的分解的影响具有一定的交互作用。

2.2.2 X射线衍射（XRD）分析 利用XRD分析煅制过程中物相的变化和可能出现的新物相[10]。仪器的检测条件为：Cu Kα射线，石墨单色器，管压36 kV，管电流30 mA，扫描速率8°·min-1，步长0.01°，扫描范围15°～70°。利用JADE6.0对XRD图谱进行寻峰处理。结果如图2所示。

图2 牡蛎及不同煅制品X射线衍射图谱Fig 2 XRD patterns of oysters and different calcined products

生牡蛎在2θ为23.05、29.40、31.43、35.97、39.41、43.16、47.11、48.50、57.39等处有衍射峰，符合碳酸钙 的标准PDF卡片（PDF 47-1743）；低温煅制牡蛎的衍射图谱并没有明显的变化，直至700℃煅3 h，800℃煅2 h时样品衍射图谱中出现了符合氧化钙的标准卡片（PDF 48-1476）的峰，分别在2θ为32.14、35.99（700℃煅3 h）；32.14、35.82、53.75（800℃煅2 h）处，这表明牡蛎在700℃下煅制3 h或在800℃下煅制2 h即有部分碳酸钙开始分解。800℃煅3 h以上煅品和900℃煅2 h以上煅品的衍射图谱与氧化钙特征衍射峰基本重合，无碳酸钙相关衍射峰，表明在800℃下煅制3 h以上或在900℃下煅制2 h以上时样品中碳酸钙已完全分解。当煅制温度＞600℃时，煅制温度和煅制时间对牡蛎碳酸钙的分解具有交互影响。

2.2.3 质构分析 利用TMS-Touch物性分析仪对牡蛎及不同条件煅制品的硬度进行测定。软件（Texture Lab Pro）设置参数为（量程800 N或40 N，测试速度为30 mm·min-1，形变量100%），选择TMS 2 mm Steel针型检测探头进行测量。结果如图3所示，硬度主要受煅制温度的影响，煅制时间的影响不大。当煅制温度高于300℃时，样品硬度明显变小。随着煅制温度的升高，煅品硬度逐渐变小，酥脆程度明显增加。

图3 牡蛎及不同煅制品硬度（*P＜0.05）Fig 3 Hardness of oysters and different calcined products（*P＜0.05）

2.2.4 水煎液pH值及钙离子含量测定 精密称取2 g样品粉末，分别加入10倍和8倍量的水先后煎煮60 min，得到水煎液，使用pH计对水煎液pH值进行测定。采用《中国药典》2020年版[1]中牡蛎含量测定方法对水煎液中钙离子含量进行测定。结果如图4所示，与生品相比，400℃2～4 h煅品以及500～900℃煅品水煎液pH值显著升高。

图4 牡蛎及不同煅制品水煎液的pH值（A）和钙离子含量（B）（*P＜0.05）Fig 4 pH of decoction（A）and calcium ion content（B）of oysters and different calcined products（*P＜0.05）

2.2.5 聚类分析 对牡蛎及不同条件煅牡蛎的硬度、水煎液pH值、水煎液钙离子含量等理化性质结果进行系统聚类分析。结果如图5所示，样品可分为三类，分别为第一类（生品、100℃煅品和200℃煅品），第二类（300℃煅品、400℃煅品、500℃煅品以及600℃1 h/2 h/3 h煅品）和第三类（600℃4 h煅品、700℃煅品、800℃煅品、900℃煅品）。

综合上述实验结果选取100℃、400℃、600℃以及900℃下各煅制4 h样品进行大鼠抗实验性胃溃疡作用研究。

2.3 抗大鼠实验性胃溃疡作用研究

2.3.1 动物分组、给药与造模 将动物分为模型组、正常组、阳性药（硫糖铝）组、生品低剂量组、生品高剂量组、100℃煅品低剂量组、100℃煅品高剂量组、400℃煅品低剂量组、400℃煅品高剂量组、600℃煅品低剂量组、600℃煅品高剂量组、900℃煅品低剂量组、900℃煅品高剂量组、碳酸钙低剂量组、碳酸钙高剂量组、氧化钙低剂量组、氧化钙高剂量组。

分别取一定量100℃4 h煅品、400℃4 h煅品、600℃4 h煅品、900℃4 h煅品样品粉末、碳酸钙对照品、氧化钙对照品，各加入10倍量纯净水煎煮两次，过滤浓缩得到低剂量（0.14 g·mL-1）和高剂量（0.28 g·mL-1）药液。阳性药组将硫糖铝口嚼片研磨过100目筛，加适量纯净水制成0.043 g·mL-1药液。

按照1 mL/100 g给药，每日一次，连续给药6 d，末次给药前24 h禁食不禁水。模型组及正常组给予同等体积纯净水。除正常组外，其余各组末次给药后1 h灌胃2 mL含60%乙醇的0.15 mol·L-1盐酸溶液进行造模[11]，正常组给予等量纯净水。

2.3.2 胃液pH值测定 造膜1 h后，腹腔注射10%戊巴比妥麻醉大鼠，结扎幽门与贲门后，取胃，剪一小口收集胃液，利用精密pH试纸（0.5～5.0）测定胃液pH值。结果如图6所示，与模型组相比，900℃煅品高剂量组、氧化钙高剂量组胃液pH值明显升高，这可能与药液pH值偏大有关。与正常组相比，生品低、高剂量组，400℃煅品高剂量组，900℃煅品低、高剂量组，碳酸钙低、高剂量组，氧化钙低、高剂量组胃液pH值显著增大。

图6 牡蛎及不同煅制品对实验性胃溃疡大鼠胃液pH值的影响Fig 6 Effect of oysters and different calcined products on the pH of gastric juice of rats with experiment gastric ulcer

2.3.3 溃疡指数及溃疡抑制率测定 沿胃大弯将胃剪开，展开并平铺于桌面，利用相机进行电子成像，利用PS软件统计溃疡面积，按照以下公式计算溃疡指数与溃疡抑制率[12]。溃疡指数（%）＝溃疡部分面积/胃部总面积×100%；溃疡抑制率（%）＝（模型组溃疡指数-给药组溃疡指数）/模型组溃疡指数×100%。结果如图7所示。与模型组比较，除生品给药组外，其余各组给药后溃疡指数均显著减小，表明牡蛎煅制后均具有抗胃溃疡作用，以600℃4 h煅品、900℃4 h煅品作用更好，两者作用优于碳酸钙和氧化钙。

图7 牡蛎及不同煅制品对实验性胃溃疡大鼠溃疡指数（A）与溃疡抑制率（B）的影响Fig 7 Effect of oyster and different calcined products on ulcer index（A）and ulcer inhibition rate（B）in rats with experimental gastric ulcer

2.3.4 形态学观察和组织病理学检查 剪取大约0.5 mm×0.5 mm大小胃组织，置于10倍量的甲醛溶液中进行固定，包埋，切片，并进行HE染色，在显微镜下观察组织病理变化。

图8为各给药组的胃组织病理切片。正常组胃黏膜细胞形态正常，排列分布整齐致密。模型组胃黏膜细胞形态严重缺损，可见明显细胞裂隙，大范围炎细胞红细胞浸润。阳性药组胃黏膜细胞形态保持良好，排列致密，仅胃壁深处微有炎细胞浸润，无红细胞浸润。生品、100℃煅品、400℃煅品及碳酸钙组明显可见细胞肿胀失活，细胞间隙明显增大，胃黏膜破损。生品组还可见胃壁处明显炎细胞和红细胞浸润。600℃煅品组胃黏膜细胞微有破损但胃壁组织细胞形态良好，组织致密，无明显裂隙，微有炎细胞浸润。900℃煅品低高剂量组均可见细胞肿胀，偶有失活，胃黏膜轻微缺损，可见炎症细胞浸润。氧化钙低高剂量组均可见胃黏膜明显损伤，细胞肿胀，细胞间隙明显变大，炎细胞浸润。

2.3.5 大鼠胃组织生化指标测定 刮取胃黏膜组织，加入适量生理盐水制成10%组织匀浆。利用对应试剂盒测定胃组织中NO、PGE2、SOD、GSH-Px、TNF-α、IL-4水平，结果如图9所示。

图9A显示与模型组相比，阳性药组、600℃煅品高剂量组，碳酸钙高剂量组及氧化钙低、高剂量组的胃组织中NO明显增多。图9B显示与模型组相比，阳性药组，生品高剂量组，100℃煅品低、高剂量，400℃煅品高剂量组，600℃煅品低、高剂量组的胃黏膜中PGE2水平明显增高。图9C为不同给药组胃黏膜中SOD活力，与模型组相比，给药组差异无统计学意义。图9D为不同给药组胃黏膜中GSH-Px活力，结果显示给药组与模型组相比，差异无统计学意义。图9E为不同给药组胃黏膜中TNF-α分泌水平，结果显示与模型组相比，100℃煅品低剂量组和400℃煅品高剂量组明显降低。图9F为不同给药组胃黏膜中IL-4分泌水平，结果显示给药组与模型组相比，差异无统计学意义。

综上所述，生品可增加PGE2水平；100℃煅品、400℃煅品可增加PGE2水平，降低TNF-α水平；600℃煅品可增加NO、PGE2水平。

4 讨论

牡蛎的炮制工艺不定，市售药材饮片质量参差不齐，优化牡蛎的煅制工艺十分重要。本文通过红外光谱和X射线衍射图谱确定了不同条件所得牡蛎煅制品的物相组成，通过测定硬度、水煎液pH值、钙离子溶出度对不同条件煅制品的理化性质进行初步了解，并进行系统聚类分析将样品分为三类。传统认为，牡蛎煅制后具有制酸止痛的功效，本研究以盐酸乙醇诱导实验性胃溃疡模型来筛选牡蛎的最佳炮制工艺，结果表明牡蛎煅制后均具有抑制溃疡的作用，其中600℃4 h煅品和900℃4 h煅品作用最强。生化指标检测结果表明不同条件煅牡蛎的抗胃溃疡作用机制可能不同，100℃煅品、400℃煅品、600℃煅品可提高组织中PGE2水平，900℃煅品对各生化因子并无明显作用。

药效作用的不同可能与理化性质的改变有一定关系。400℃煅品的组成主要为碳酸钙，但其质地明显变酥脆，药液更容易进入，胃液pH值略高于100℃煅品给药组。600℃煅品的组成既有碳酸钙也有氧化钙，质地更酥脆。900℃煅品为纯氧化钙，可明显提高胃液pH值起到中和胃酸减缓伤害的作用。但其属于强碱氧化物遇水反应发热对黏膜具有强烈的刺激性，临床长时间使用可能会引起患者不适。

牡蛎为生熟异用品，生品重镇安神，煅品制酸止痛。选择合理的指标对生品、煅品进行质量控制是必要的。目前多数炮制研究都是以钙离子溶出作为主要的评价指标，无法体现出生品、煅品的差异。本研究结合质构、钙离子溶出、水煎液pH值和抗胃溃疡作用综合分析，优化炮制工艺，结果更加全面可靠。