基于网络邻近度方法探讨枣仁五味苓志复方改善睡眠的作用机制

曹永军,任爱蓉,江建辉,王雅溶,张世勋,赵 宸,梁泳茵,崔国祯,范 庆

(1.遵义医科大学珠海校区 生物工程学院,广东 珠海 519041;2.澳门大学中华医药研究院 中药质量研究国家重点实验室,澳门 999078;3.遵义医科大学珠海校区 基础教学部,广东 珠海 519041)

睡眠是人类维持生命活动的重要生理功能,保持良好的睡眠对人类健康至关重要［1］。失眠作为最常见的睡眠障碍,已成为全球性的公共问题之一［2］,其症状包括入睡困难、睡眠恢复困难以及睡眠质量差等［3］。在临床诊断中,每周至少出现3次、持续3个月以上的入睡困难或无法维持良好睡眠状态者被诊断为失眠［4］。目前市面上的失眠治疗药物如苯二氮卓类、唑吡坦和多西他赛等,虽然疗效显著,但存在成瘾及耐药性等副作用,长期使用可能导致肌肉松弛、健忘和认知障碍等不良后果［5］。相较而言,中草药干预失眠具有较低的药物依赖和成瘾,不良反应较少的优势［6］。中医药治疗失眠由来已久,大量循证学证据表明中药复方治疗失眠效果良好［7］,改善失眠的复方主要是以补虚、安神用药为主,同时配伍清热药、平肝药、活血行气等药物,与中医学补虚泻实,调整阴阳的疗法不谋而合,故而产生较好的疗效［8-9］。枣仁五味苓志复方(ZiziphusJujubaandSchisandrachinensis, ZWLZ)是一种中草药制剂,由酸枣仁、五味子、远志、茯苓和L-茶氨酸等组成。这些中药在中医传统中被广泛应用于治疗失眠和其他与精神状态相关的疾病,在临床实践中表现出显著的效果［10-11］。然而,其成分复杂以及作用机制尚不明确的问题也引起了研究者的关注。

网络医学认为人体细胞中分子之间的功能呈现互相依赖,疾病表型通常反映了复杂网络中相互作用的多种病理生物学过程［12-13］,是大数据时代药物系统性研究的新兴交叉学科。其中,用于研究药物的网络邻近度方法是建立在人类蛋白相互作用组的网络框架之上［14］。它构建了调控疾病的基因网络与药物靶点网络,并通过网络邻近度计算来量化疾病基因集(疾病模块)与药物靶点集(药物模块)之间的相互作用,从而达到快速筛选候选药物的目的［13, 15］。本研究根据《保健食品功能检验与评价方法(2022年版)》方法选用BALB/c小鼠作为实验模型,探究了ZWLZ对小鼠睡眠质量的改善作用。同时,采用液相色谱-高分辨质谱法(UPLC-QTOF-MS)对其有效成分进行了检测。在此基础上,进一步运用网络医学中网络邻近度方法,深入探讨ZWLZ改善睡眠功效的物质基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验药品 5-羟色胺试剂盒购自南京森贝伽生物科技有限公司(H104-1-2);γ-氨基丁酸检测试剂盒购自南京森贝伽生物科技有限公司(H168-1-2);戊巴比妥钠购自山东西亚化学工业有限公司(F074);巴比妥钠购自山东西亚化学工业有限公司(E7038);地西泮片购自山东信谊制药有限公司(211205)。

1.1.2 ZWLZ的制备 ZWLZ制备工艺如下：分别将4种中药干燥粉碎,沸水提取经浓缩、干燥、粉碎,得到干膏粉(50目过筛2次)。干膏粉与L-茶氨酸按163∶30质量比例混合,即为ZWLZ。酸枣仁、五味子、茯苓、远志生药与L-茶氨酸质量比例为3∶3∶3∶2∶0.3。

1.1.3 动物实验 雄性BALB/c小鼠,7～8周龄,体重18～20 g,购自广东省医学实验动物中心,动物合格证号：SCXK(粤)2018-0002。本研究经过遵义医科大学实验动物福利伦理委员会的批准,伦理审批号为ZMU21-2303-061。

1.2 方法

1.2.1 实验分组与给药 按照参考文献［16］,所有动物均被饲养在恒温(24±2)℃、相对湿度(55%±15%)的空调房内。房间保持在12 h亮/12 h暗交替循环中。实验前动物适应性饲养5 d,自由饮食。实验动物随机分为溶媒对照组(Ctrl,蒸馏水)、阳性药物组(Diaz,地西泮水溶液,2.5 mg/kg),以及根据成人每日推荐ZWLZ摄入量的10倍和30倍分别设置的ZWLZ低剂量组(0.32 g/kg)和ZWLZ高剂量组(0.96 g/kg),每组10只动物。每只动物以0.1 mL/10 g的体积灌胃给药,连续30 d,期间每周测定1次各组动物的平均体重。

1.2.2 直接睡眠实验 连续给药30 d,所有实验小鼠末次灌胃后,观察各组小鼠30 min内是否有睡眠现象。观察时以灌胃结束的时刻为开始时间、翻正反射消失为判断标准。当正常小鼠处于仰卧位时,它们会立即将身体向右翻转。如果矫正时间超过30～60 s,则认为翻正反射消失并进入睡眠状态。

1.2.3 延长戊巴比妥钠睡眠时间实验 实验小鼠末次灌胃30 min后,腹腔注射戊巴比妥钠水溶液(剂量54 mg/kg注射,体积0.1 mL/10 g),以翻正反射消失为指标,测量睡眠潜伏期(从戊巴比妥钠给药到小鼠翻正反射消失的时间)和睡眠时间(从翻正反射消失到其恢复的时间)。

1.2.4 巴比妥钠睡眠潜伏期实验 实验小鼠末次灌胃30 min后,腹腔注射巴比妥钠水溶液(剂量250 mg/kg,体积0.1 mL/10 g,药物剂量参考标准剂量200～300 mg/kg并通过预实验确定为250 mg/kg),以翻正反射消失为指标,测量睡眠潜伏期(从巴比妥钠给药到小鼠翻正反射消失的时间)。

1.2.5 小鼠脑组织5-羟色胺和γ-氨基丁酸含量测定 连续灌胃30 d后,颈椎脱臼处死小鼠,并迅速分离脑组织。将小鼠脑组织用预冷的磷酸盐缓冲液清洗,去除残留血液,称重后剪碎。将剪碎的组织与相应体积的生理盐水混合(质量/体积比为1∶9),充分匀浆并离心(8 000 g,4 ℃,15 min)后,收集上清液。严格按照5-羟色胺和γ-氨基丁酸酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒检测小鼠脑中5-羟色胺和γ-氨基丁酸的含量。

1.2.6 基于网络邻近度方法探讨ZWLZ改善睡眠功效的物质基础和作用机制

1.2.6.1 UPLC-QTOF-MS质谱检测条件 根据文献方法进行修改和优化［17］。采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(2.1 mm× 50 mm,1.8 μm);柱温：40 ℃;流动相：0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脱(0～2 min,10% B→10% B;2～16 min,10% B→90% B;16～17 min,90% B;17～18 min,90% B→10% B;18～20 min,10% B);流速：0.3 mL/min;进样量：2 μL。质谱条件：电喷雾离子源(ESI),正、负离子MSe连续扫描模式;扫描50～1 200 m/z;毛细管电压3.0 kV;离子源温度150 ℃;脱溶剂气温度350 ℃;脱溶剂气流速600 L/h;锥孔电压25 V;锥孔气流量50 L/h;校正液使用化合物为亮氨酸-脑啡肽(正离子为556.277 1,负离子为554.262 0);数据采集软件使用Masslynx V4.1工作站。

1.2.6.2 化学成分的鉴定 通过PubMed［18］、TCMSP［19］、Chemspider［20］等数据库对ZWLZ的化合物进行系统检索,建立化合物名称、分子式及结构式(mol文件格式)数据库并导入UNIFI科学图书馆中,与UNIFI信息平台中内置的中药化学成分数据库共同作为筛选数据库。利用UNIFI 1.8.0软件自动筛查、计算分子式以及分析碎片断裂情况,鉴定化合物以及匹配其碎片离子的结构特征。结合碎片离子理论精确质量数、相对保留时间及相关文献对化合物进行人工识别和确认。

1.2.6.3 有效成分靶点的收集 把ZWLZ中通过“UPLC-QTOF-MSE”检测到的每种化学成分的名称分别输入到CTD［21］、DrugBank［22］、TTD［23］、IUPHAR/BPS Guide to pharmacology［24］和BindingDB［25］数据库中检索“药物靶点”。合并每个成分在不同数据库中检索得到的所有“药物靶点”,并删除重复的靶点。每个“药物靶点”都在NCBI检索验证并统一命名,然后转换为Entrez ID并整理成CSV文件备用。所有包含的“疾病基因”和“药物靶点”都需要在数据库中被标识有实验证据才能纳入。

1.2.6.4 睡眠障碍相关直接调控基因的收集 通过医学主题词(MeSH)和统一医学语言系统(UMLS),获得与睡眠障碍相关的4个医学主题词：“sleep wake disorder”、“insomnia”、“circadian rhythm sleep disorders”和“sleep disorder”,并将它们作为关键词用于Uniport［26］、TTD［23］、CTD［21］和DisGeNET［27］中的“疾病靶点(基因)”检索。然后,将每个“疾病靶点”输入NCBI［28］数据库进行统一验证和重命名,然后将其转换为Entrez ID并以CSV格式保存。

1.2.6.5 网络邻近度的计算 根据报道的方法(如式1所示),计算药物(配方药中的每一种组分)和疾病之间的网络邻近度［13］。给定s为疾病靶点蛋白集S中的1个,t为药物靶点蛋白集T中的1个。通过固定T中某个药物靶点(t),计算其与1组疾病靶点蛋白集(S)中不同靶点(s)的距离,找出最小值即为该药物靶点(t)与疾病靶点(s)的最近距离mins∈Sd(s,t)。对T中其他药物靶点进行同样的计算后,可以获得‖T‖个药物靶点的距离;把这些距离相加,除以药物靶点个数即得到此有效成分靶点到疾病基因蛋白的邻近度dc(S,T)。

(1)

为了评估药物和疾病之间网络接近的重要性,构建参考距离分布。该参考距离分布对应于1 000对随机选择的2个蛋白质组之间的预期距离(两随机选择组之间的邻近度),这些蛋白质组的大小和度的分布与原始疾病蛋白和药物靶点的相同。然后在获得1 000个预期距离后,得到参考分布的平均距离μd(S,T) 和标准差σd(S,T) ,将药物-疾病邻近度转换为标准距离来计算Z值(式2),即相对网络邻近度。当计算距离大于平均距离时,可以获得正的标准化分数,反之则得到负的标准化分数,Z值越小表示其相对距离越近。为了方便网络邻近度等相关网络医学的计算和分析,构建了在线网络计算平台,部署在www.zmupredict.cn域名下开放使用［29］。用户可免费访问该平台,提交数据进行网络医学相关计算(现有邻近度计算、子网络提取、联合用药计算3个模块)。

(2)

2 结果

2.1 ZWLZ对实验小鼠的直接催眠实验结果 ZWLZ处理组小鼠30 min内均未出现翻正反射消失现象,入睡动物和睡眠时间均为0,表明ZWLZ对小鼠无直接睡眠作用。

2.2 ZWLZ对戊巴比妥钠诱导睡眠实验结果和动物体重的影响 在戊巴比妥钠诱导的睡眠模型中,评价了ZWLZ对小鼠的睡眠潜伏期、睡眠时间和体重变化的影响(图1)。如图1A所示,ZWLZ干预后可缩短小鼠的睡眠潜伏期,低剂量组(0.32 g/kg)和高剂量组(0.96 g/kg)与对照组相比都有显著性差异(P< 0.05)。ZWLZ干预后可增加小鼠的睡眠时间,与空白组相比,高剂量组(0.96 g/kg)具有显著性差异(P< 0.05,图1B)。各组实验小鼠的体重变化无显著性差异(图1C,P>0.05),表明ZWLZ不会对小鼠的体重产生明显影响。

A：小鼠睡眠潜伏期;B：睡眠时间;C：体重变化;Ctrl：对照组;Diaz：地西泮;ZWLZ：枣仁五味苓志复方;Pent：戊巴比妥钠;*：与对照组比较, P< 0.05。图1 ZWLZ干预后各组小鼠睡眠潜伏期、睡眠时间及体重的情况

2.3 ZWLZ对巴比妥钠诱导实验小鼠睡眠潜伏期的影响 巴比妥钠诱导睡眠模型下,ZWLZ对实验小鼠睡眠潜伏期的影响如图2所示。ZWLZ干预后缩短了小鼠的睡眠潜伏期,其中高剂量组(0.96 g/kg)与对照组相比差异显著(P<0.05)。

Ctrl：对照组;Diaz：地西泮;ZWLZ：枣仁五味苓志复方;Barb：巴比妥钠。*：与对照组比较, P< 0.05。图2 ZWLZ干预后巴比妥钠诱导睡眠实验小鼠睡眠潜伏期

2.4 ZWLZ对小鼠脑组织5-羟色胺和γ-氨基丁酸含量的影响 ZWLZ干预后对小鼠脑组织中5-羟色胺和γ-氨基丁酸含量的影响如图3所示。结果显示,ZWLZ干预后增加了5-羟色胺的含量(图3A)和γ-氨基丁酸的含量(图3B),其中高剂量ZWLZ组(0.96 g/kg)与对照组比较都具有显著性差异(P< 0.05)。

A：小鼠脑组织5-羟色胺含量;B：γ-氨基丁酸含量;Ctrl：对照组;Diaz：地西泮;ZWLZ：枣仁五味苓志复方;5-TH： 5-羟色胺;GABA：γ-氨基丁酸;Barb：巴比妥钠;*：与对照组比较, P< 0.05。图3 ZWLZ干预后小鼠脑组织5-羟色胺和γ-氨基丁酸的含量

2.5 化学成分的鉴定 通过PubMed、TCMSP、Chemspider等数据库对ZWLZ的化合物进行系统检索,将化合物名称、分子式及结构式导入UNIFI科学图书馆中,与UNIFI信息平台中内置的中药化学成分数据库共同作为筛选数据库。利用UNIFI软件,鉴定化合物以及匹配其碎片离子的结构特征以进行人工识别和确认。最终鉴定出ZWLZ中的222个成分。ZWLZ的基峰离子色谱如图4所示。

A：ZWLZ正离子峰色谱;B：ZWLZ负离子峰色谱。图4 UPLC-Q/TOF-MS法分析ZWLZ色谱

本文采用了UPLC-Q/TOF-MS分析方法对ZWLZ进行色谱图分析。图4A展示了ZWLZ的正离子峰色谱,图4B则展示了其负离子峰色谱。该方法可以用于对中药复方的成分分析和质量控制。这些分析结果为ZWLZ的质量评价和临床应用提供了可靠的依据。

2.6 网络邻近度的计算

2.6.1 疾病基因和化学成分靶点的收集结果 将“UPLC-QTOF-MSE分析”检测到的每个化学成分的名称导入CTD、DrugBank、TTD、IUPHAR/BPS Guide to pharmacology和BindingDB中进行“药物靶点”搜索。将不同数据库中每个成分的“药物靶点”合并,去除重复的目标。将“sleep wake disorder”、insomnia”、“circadian rhythm sleep disorders”和“sleep disorder”作为关键词用于Uniport、TTD、CTD和DisGeNET中的“疾病基因”检索。然后,将每个“药物靶点”输入NCBI进行统一验证和重命名,并将其转换为Entrez ID以CSV格式保存。所有包含的“疾病目标”和“药物靶点”都需要经过“验证”或有实验证据。本研究获得了236个化学靶点和90个疾病靶点。

2.6.2 网络邻近度计算结果 将化学成分与疾病靶点关联至人类蛋白质相互作用网络,并计算疾病相关基因对应的蛋白集合与活性成分靶点集合之间的网络邻近度。接着,筛选出那些满足Z-score <-1.0且P< 0.05的成分。经过分析,结果显示茶氨酸、麦角胺和去氢骆驼蓬碱等8个成分均符合上述标准,详细数据见表1。

为了理解有效成分改善睡眠的作用蛋白,可以构造药物蛋白与疾病基因连接网络。按照Z-score和P值的范围,我们取排名靠前的4个成分构建了ZWLZ干预睡眠障碍的代表性潜在有效成分的靶点和疾病基因相互作用的网络图。如图5所示,其中的4个活性成分的靶点共28个,对应疾病基因24个,其中成分和疾病共同靶点13个。同时,多个成分可能共同对应一个疾病基因(如图中ADRA1D、DRD2、NTRK1),体现了中药多成分对应多靶点与多途径的功能反应。

ZWLZ的有效成分化合物Theanine、Ergotamine、Harmine、Quercitrin与治疗睡眠障碍相关的靶点和疾病靶点表现出了较强的相互作用关系,形成了复杂的网络关系图;橙色表示化合物;绿色表示化合物靶点;紫色表示化合物和疾病之间的共同靶点;粉色表示疾病基因。图5 ZWLZ治疗睡眠障碍的化合物和靶点网络分析

3 讨论

本研究的结果表明,ZWLZ在给药后,显著延长戊巴比妥钠诱导睡眠实验的小鼠睡眠时间,显著缩短巴比妥钠诱导睡眠实验小鼠的睡眠潜伏期。脑组织匀浆指标检测显示ZWLZ高剂量组药物干预后显著增加脑组织的5-羟色胺和γ-氨基丁酸含量。根据保健食品功能检验与评价方法对结果进行判断,ZWLZ具有改善睡眠的作用。其次,该研究利用网络医学方法,建立了药物-疾病靶点网络,并筛选出了8个与ZWLZ改善睡眠有关的潜在活性成分,如茶氨酸、麦角胺、哈尔敏等,该结果不仅可以更深入地理解药物的作用机制,还有助于识别出可能的活性成分,为进一步的药物开发提供线索。

网络邻近度计算方法作为一种新兴研究方法,可以用于深入分析中药的有效成分与调控网络。本研究中,通过液相色谱-质谱联用的方法检测ZWLZ的成分,然后采用计算网络邻近度的方法,预测到的有效成分中,排名第一位的是茶氨酸(也称γ-谷氨酰乙酰胺)。茶氨酸作为一种天然氨基酸,能够对抗神经紧张和焦虑,从而有助于改善睡眠［30］。麦角胺具有增强巴比妥类、吗啡和美沙酮的镇静和催眠作用［31］。哈尔敏具有抗抑郁作用,可减轻焦虑和压力,从而提高睡眠质量［32］。槲皮苷和异槲皮苷具有类似的促睡眠作用,有研究表明槲皮苷和异槲皮苷都以剂量依赖性方式增加了戊巴比妥诱导的小鼠睡眠时间［33］。研究表明,诃子酸具有抗抑郁和抗焦虑潜力［34］。番泻苷α可以调节肠道功能,减轻因消化不良引起的睡眠障碍［35］。六氢姜黄素表现出与姜黄素相似或更有效的生物活性,如抗氧化、抗炎、抗肿瘤和心血管保护特性［36］。由网络分析图可发现,ZWLZ中多个成分可能共同对应一个疾病基因,进一步分析可发现8个药物成分中有6个可对应疾病基因高亲和力神经生长因子受体(NTRK1),NTRK1编码神经营养性酪氨酸激酶受体,可与神经营养因子结合,有研究表明其与抑郁、焦虑、睡眠障碍等症状存在相关性［37］。有研究报道,MEIS1是与失眠关系最为紧密的基因(该基因与药物成分中槲皮苷、番泻苷α有直接联系)。这个基因编码了1个转录因子,能够控制与激活其他基因的表达,可能调节抑制性神经元分化,从而导致失眠［38］。Spieler等［39］报道在小鼠模型中,MEIS1的表达导致昼夜节律亢进,这是一种与不宁腿综合征相容的表型,进而产生失眠效应。因此可以推测ZWLZ可能通过其主要成分槲皮苷、番泻苷α以及六氢姜黄素来干预NTRK1和MEIS1等基因的表达,进而干预睡眠。

地西泮作为一种经典的苯二氮类药物,广泛用于治疗失眠和焦虑等疾病。其临床效果明确、作用速度快,因此在研究中常作为用于改善睡眠的阳性药物［29,40］。有趣的是,在本研究中,观察到以中草药和天然产物组成的ZWLZ在高剂量(0.96 g/kg)下能显著改善戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠潜伏期,并提升小鼠脑组织中5-羟色胺与γ-氨基丁酸的水平。相较之下,地西泮组与对照组相比在统计学上并没有显著差异。这些差异性可能源于ZWLZ配方具有多成分和多靶点作用机制。大量的研究结果表明,γ-氨基丁酸具有改善焦虑、缓解高血压和糖尿病等功能［41］。本课题组研究结果结合最近的研究进展,提示了ZWLZ在改善睡眠之外,可能具有更广泛的治疗适应症,这为未来的研究提供了新的方向。针对这一现象,未来值得进一步深入研究,不仅可以全面评估2种治疗方法的优劣,还有可能促成两者在临床应用中的互补与整合。

综上所述,ZWLZ以多成分和多靶点为特点,可能通过不同的调控网络机制来改善睡眠质量。这一研究成果有助于拓展中药在睡眠障碍领域的应用,为相关领域的研究与开发提供新的方向。同时,研究提示网络医学的方法为中药的研发提供了新的思路和方法,为发掘更多的天然药物资源奠定了基础。未来研究可进一步探讨各成分之间的协同作用机制,以提高药物的疗效。此外,还可针对不同类型的睡眠障碍开展研究,为临床治疗提供更为精确的治疗方案。