活性炭氧化改性对血小板和溶血性的影响

钟 悦,葛晓丽,周 巡,刘雨瑶,王 峰,钟永科

(1.遵义医科大学附属第二医院 胸心外科,贵州 遵义 5630099;2.遵义医科大学药学院 分析化学教研室,贵州 遵义 5630099)

血液灌流是抢救急性药物中毒病人的常用方法 ,在治疗肝功能衰竭、高胆红素血症等疾病上也有重要应用,其治疗的原理在于灌流装置中的吸附剂能吸附脱除病人血液中的有毒有害物质［1-8］。此外,血液灌流还用于治疗新冠病毒引起的肺部急性呼吸系统综合征［9］。由于吸附容量高且可吸附不同尺寸的有毒有害物,活性炭在灌流中常被用作吸附剂［2-6］。

血液相容性指生物医用材料与血液接触后所产生的符合要求的生物学反应性能,其中,溶血性和凝血性是血液相容性的重要指标。血液相容性好、毒物吸附量高是血液灌流对活性炭的2个核心要求,遗憾的是这2个要求之间一直存在着矛盾［6,10-12］。活性炭是炭质材料经高温活化处理获得的发达多孔材料［13］,发达的孔道使其具备吸附容量高和孔径分布广泛的特点,灌流时直接使用对毒物的吸附脱除好且适应的毒物尺寸广泛,但灌流后血液存在血小板减少、凝血等问题［6,10］;为解决这一问题,发明了纤维素和蛋白质等材料对活性炭的包膜,但包裹的薄膜会降低毒物向活性炭的扩散,甚至完全阻碍大尺寸的毒物吸附,影响活性炭对毒物的吸附脱除及应用［6,12］。

除具有吸附容量高和孔道结构丰富外,活性炭的另一特点是其表面存在羧酸、酚羟基和内酯基等含氧基团,通过活性炭表面处理,它们的数量还可进行调控［14-15］。活性炭高温活化处理存在的问题是高温会裂解含氧基团,因此其表面含氧基团很少。近来,在炭材料(如炭纳米管)表面引入亲水基团以改善其血液相容性的研究已有报道［16-17］。受此启发,本文通过对活性炭氧化改性以引入含氧基团,考察了活性炭氧化改性对兔血血小板和溶血性的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 活性炭原炭(80～100目,煤质)购自承德冀北燕山活性炭有限公司;实验兔血采自本校实验动物中心饲养的白兔,实验经本校实验动物伦理委员会审核,并获得批准(伦理审查编号：ZMU21-2306-098);胎牛血清购自SORFA公司(sx1500);BCA蛋白试剂盒购自索莱宝公司(PC0020)。

1.1.2 仪器 静态氮吸附仪(JW-BK122W,北京精微高博);扫描电子显微镜(S-3400N型,Hitachi公司);全自动血细胞分析仪(XS-1000i,日本Sysmex公司);双光束紫外可见分光光度计(MODEL U-3010,日本Hitachi公司);酶标仪(Multiskan FC,美国赛默飞)。

1.2 方法

1.2.1 活性炭的改性 活性炭原炭预先水洗除去浮炭后,取100 g,加入800 mL浓度为 15 % 的硝酸溶液,室温浸泡24 h后取出30 g 左右,余下活性炭加热回流1 h时,再取出30 g左右,最后余下的活性炭再处理1 h,取出。所有活性炭反复水洗至pH恒定,60 ℃下烘干,储存在干燥器中备用。依据活性炭氧化时取出的先后,依次将所得活性炭标示为AC1、AC2和AC3。未处理的活性炭原炭标示为AC0。

1.2.2 活性炭的表征方法 Boehm滴定法是定量检测活性炭表面含氧基团的有效方法［18-19］。活性炭表面含氧基团的变化采用Boehm滴定方法检测：精确称取活性炭0.5 g,分别加入50.0 mL浓度为0.500 mol/L的NaHCO3、Na2CO3和NaOH的标准溶液,密封后在25 ℃的恒温水浴振荡器中振摇反应24 h,离心,取上清液10.0 mL用盐酸滴定,根据上清液消耗的盐酸的量计算活性炭表面所含的羧基、内酯基、酚羟基的数目。活性炭的织构表征在静态氮吸附仪上进行,测试条件：液氮环境,首先分别用氦气和氮气吸、脱附3次,然后在150 ℃下脱气活化2 h,比表面选点范围 (P/P0) 0.05 ～ 0.3。活性炭形貌变化采用扫描电子显微镜观察,观察前样品喷金处理,20 kV电压。

1.2.3 血小板检测 准确称取0.10 g预先用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液调整过表面pH的活性炭,加入10.0 mL生理盐水,37 ℃下浸泡30 min,加入0.75 mL预先准备的新鲜兔血(ACD兔血,新鲜兔血加入25 %体积比pH 7.4的柠檬酸钠-葡萄糖-柠檬酸溶液),37 ℃下水浴摇床中在80 r/min的摇速下摇10 min,取出,160目绢布过滤后用Sysmex全自动血细胞分析仪检测血小板的数量。3个平行样同时检测。

1.2.4 溶血性测定 准确称取0.15 g预先用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液调整过表面pH的活性炭,加入10.0 mL的0.9 %生理盐水在37 ℃下水浴30 min,然后加入0.20 mL预先准备的ACD兔血,37 ℃下水浴60 min,1 000 r/min离心10 min,取上清液在540 nm下测定吸光度。实验同时进行阳性和阴性对照,阳性对照加入10.0 mL去离子水,阴性对照加入10.0 mL浓度为0.9 %的氯化钠溶液,再分别加入0.20 mL的ACD兔血,对照组均不加活性炭样品,其他操作与加入活性炭样品的实验完全相同。每个样品测3个平行样。HR(溶血率)计算采用：

HR=(At-Anc)/(Apc-Anc)

其中,At为试样组吸光度,Anc为阴性对照组吸光度,Apc为阳性对照组吸光度。

1.2.5 血浆蛋白吸附含量测定 准确称取0.20 g预先用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液调整过表面pH的活性炭,加入5.00 mL的5 %胎牛血清稀释液,37 ℃恒温振摇8 h,离心,取上清液经BCA试剂盒处理后上酶标仪,测定562 nm处的吸光度。通过BCA标准曲线,得出胎牛血清中血浆蛋白的含量。所有样品测3个平行样。空白组不加活性炭样品。

2 结果

2.1 活性炭的表征 对活性炭进行氧化改性的方法主要有液相氧化和气相氧化处理,改性的结果是将活性炭炭质材料转化为表面含氧基团和孔结构,以液相氧化改性在活性炭表面引入的含氧基团较多。表1是使用Boehm滴定法检测的结果。结果表明,所购活性炭AC0由于经过了高温活化处理,其表面含氧基团如实验前预料的一样很少,但一经简单的浸泡,其表面含氧基团中羧酸基团和内酯基,迅速增加,进一步处理得到的活性炭AC2和 AC3,表面引入的含氧基团更多,分别达到原炭的5倍和8倍多,说明活性炭的氧化改性成效明显。

表1 Boehm 滴定的表面含氧基团 (mmol/g)

表2是氧化处理后所得活性炭的表面织构参数。结果表明,活性炭在氧化改性过程中,其表面织构参数如孔体积、比表面等随处理的增加,经历了先增加后降低的变化,这一变化趋势与表1中活性炭表面含氧基团单纯增加的趋势不同。

表2 活性炭氧化改性以后的表面织构结果

图1是活性炭氧化基团引入前后其表面形貌的变化。结果清晰可见,活性炭在含氧基团引入的过程中,无论是外层表面20 μm左右的孔道还是孔内孔径更小的孔道(约1 μm左右),它们的密度在表面氧化改性后都显示了明显的增加。

A、B：未改性活性炭;C、D：改性活性炭。图1 活性炭引入含氧基团以后的形貌变化

2.2 活性炭改性对血小板的影响 表3的结果表明,所有活性炭与血液接触后,血液中的血小板的数量均值与原血中的含量相比都减少,说明活性炭对血小板存在影响,但是,一旦活性炭被氧化改性,血液中血小板数量均值明显比未改性的增加,且随氧化处理时间的增加而增加,这意味着活性炭被改性以后,虽然活性炭都使得血液中的血小板数量减小,但活性炭改性后对血液中血小板的降低幅度减小了,且随处理时间的增加,降低的幅度呈明显递减趋势(P< 0.05),说明活性炭氧化改性缩小了活性炭对兔血中血小板的降低。

表3 活性炭氧化改性对血小板的影响

2.3 活性炭改性对溶血性的影响 表4的结果表明,未改性的活性炭溶血率(HR)均值达6.56 %,一旦将活性炭氧化处理所得活性炭AC1,其HR均值迅速下降到3.34 %,氧化处理所得活性炭AC1、AC2和AC3的HR均值比未处理活性炭 AC0的HR明显降低(P< 0.05),说明活性炭的氧化改性是降低活性炭溶血性的有效方法。

表4 活性炭氧化改性对溶血性的影响

2.4 活性炭改性对血浆蛋白吸附的影响 表5的结果表明,血浆蛋白被吸附后,氧化改性的活性炭留下的浓度均值比未改性的商业活性炭稍高,说明改性后活性炭对蛋白质的吸附下降,逐步增加的处理使活性炭AC3的蛋白质吸附比AC0明显下降(P<0.05)。

表5 活性炭氧化改性对蛋白质吸附的影响

3 讨论

活性炭改性后表面织构(表2)显示了典型的先增加后降低变化,这是因为在将活性炭氧化处理的过程中,其表面炭质直接转化为含氧基团(只增不减),同时转化留下的空间变成微孔(AC0至AC1),然后进一步的氧化处理(AC1至AC3)使微孔因被氧化刻蚀,或被扩大或被转化为介孔,因此其表面织构参数反而逐步减小［19］。图1中活性炭改性后外表明显的溶蚀指示表面含氧基团密集分布在活性炭外表［17］。

血小板是骨髓成熟巨核细胞胞浆裂解脱落下来的小块胞质,在血液凝血过程中起着极为重要的作用。血小板减小和可能出现的凝血是活性炭血液灌流时需要降低的血液相容性问题［6,10-12］。活性炭氧化改性以后血液中血小板数量增加,还意味着可能粘附在活性炭表面的血小板减少,氧化改性的活性炭因血小板吸附引起凝血的可能性降低,这一结果与其它炭材料引入亲水性的基团如N原子以后的结果相同［16-17］。同样,活性炭氧化改性以后对血液的溶血性的降低,说明氧化改性也是降低其溶血性的有效途径。

灌流中活性炭作为吸附剂,既可吸附脱除血液中的有毒有害物,也可吸附血液中其它成分而造成它们数量的减少。同时,血液与活性炭接触时本身的凝血也可能造成血小板的减小。本研究中,活性炭氧化改性以后血液中血小板数量的增加,既可能来源于改性后活性炭对兔血血小板的吸附减小,也可能来源于兔血本身的凝血减小,从血液中血小板数量增加的结果看,两种原因都有可能,因为血小板在活性炭上吸附的减小也与凝血的减小正相关,但是,不管是何种原因,氧化改性对血小板的影响都是有益的。血液溶血本质是红细胞的破裂,主要原因有机械物理损伤和材料可溶性残余低分子化学作用两方面,分为免疫性溶血反应和非免疫性溶血反应［20-21］;活性炭在液相条件下的硝酸氧化处理,既有将炭质转化为表面含氧基团和孔结构的作用,也有将活性炭表面杂质溶解清洗的作用,杂质的减少可能是溶血性降低的原因之一;同时,在引入的含氧基团中,表面羧酸在pH 7.4的环境中所呈现电离状态(-COO-),与红细胞表面的负电荷［17］相斥,既可减小活性炭表面对红细胞的粘附,也可减小血液与活性炭相对运动时活性炭对红细胞的破坏;此外,氧化还具有另外一个作用,可以将活性炭表面相对粗糙部分尤其是将表面的棱角溶蚀而使得活性炭外表变得相对光滑,这样,血液与活性炭在相对运动时(如溶血检测的高速离心分离中)氧化改性的活性炭具有更低的细胞破坏性 。

活性炭氧化改性中显著的变化是表面孔道和含氧基团的增加,血小板的尺寸大致分布在2～4 μm。理论上,活性炭氧化改性中显著增加的20 μm孔道可以成为血小板的吸附位而降低血液中的血小板数量,实际获得的相反结果说明影响血小板含量的主要因素是含氧基团的增加。一般认为,血液与材料接触后,血液中的蛋白质会很快被材料表面吸附,进而影响血液成分诱发炎症、凝血等［12］,本研究初步考察了氧化改性对牛血清蛋白吸附的影响,表5显示降低的蛋白质吸附说明活性炭通过吸附蛋白质再影响其它血液成分的可能性减少。在活性炭的氧化改性中,表面羧酸基团的增加对蛋白质的吸附减少具有重要作用,因为微酸性的表面羧酸基团在pH 7.4的环境中所呈现的电离状态-COO-与大多数蛋白质所呈现的负电荷状态相斥。

综上所述,通过对活性炭的氧化改性,减小了活性炭对兔血血小板的降低幅度和血液的溶血性,为降低活性炭灌流中可能出现的血小板粘附、凝血和溶血提供了一个可能方案。