水化温度和时间对渤海湾卤虫卵孵化的影响

刘宏宇，白东清，陈丽如，杨广

（天津农学院 水产学院 天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300392）

卤虫（Artemia salina）俗称丰年虾，属节肢动物门，广泛分布于国内外盐碱性水体中。卤虫是一种滤食性的小型低等甲壳动物，对环境的适应能力较强，繁殖周期短，易于人工养殖。而且含有丰富的蛋白质（50%～60%）、脂肪和高级不饱和脂肪酸。同时，卤虫虫体大小适宜（0.4～1.5 cm），能满足不同口裂大小的水生经济动物幼体摄食需求。因此，二十世纪三十年代以来，卤虫作为优质天然饵料被广泛应用于水产经济动物的种苗培育生产中[1]。近年来，随着水产养殖业的高速发展，卤虫的需求量越来越大，全世界有85%以上的海水养殖经济动物以卤虫作为育苗时主要的饵料[2]。

卤虫在恶劣环境条件下会产生具有较高抗性的休眠卵，休眠卵易于保存和运输，而卤虫作为饵料时主要是其无节幼体，在利用卤虫时，需要孵化其休眠卵，因此休眠卵的孵化情况成为影响卤虫利用率的关键，卤虫休眠卵的孵化率通常作为评判卤虫卵质量优劣的重要指数。国内外相关研究表明卤虫卵的孵化与水体温度、盐度、pH 值、溶解氧以及光照条件密切相关[3-4]，孵化条件影响卤虫卵的孵出时间和孵化率。SORGELOOS 等指出用自来水或海水进行水化，可以激活休眠卵，从而结束休眠状态[5]，卤虫卵在孵化前期进行水化处理，也被认为是措施之一，何相燕等（淡水、28 ℃、1 h）[6]、胡志杰等（淡水、温度未知、1 h）[7]、黄鹤忠（自来水、1 h、温度未知）[8]、SORGELOOS（自来水、28 ℃、1 h）[9]、BHUVANESHWARI等（去离子水、4 ℃、12 h）[10]、王睿等（3.5°Be’孵化液、温度未知、1 h）[11]、WHEELER 等（盐度32 的海水、28 ℃、1 h）[12]、代莉（盐度25 的海水、4 ℃、过夜）[13]先后对卤虫卵进行过孵化前的水化处理，钟其旺也将卤虫卵用自来水湿润[14]。但是，有关水化温度和时间对卤虫休眠卵孵化情况的影响鲜有人进行过系统研究。

提高卤虫卵孵化率，缩短幼体孵出时间，集中幼体孵出时段，可以有效提高卤虫卵的利用效率。本试验基于传统孵化方法，探索孵化前不同水化处理条件对渤海湾卤虫卵孵化的影响，以期为进一步优化卤虫卵的孵化方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用卤虫休眠卵为渤海湾卤虫卵（由天津丰年水产养殖公司生产），置于-20 ℃冰箱冷冻保存，解冻后4 ℃冰箱中密封暂存待用；试验用海水养殖专用盐（龙虾盐）由江西海鼎科技有限公司生产。

1.2 试验方法

配制人工海水：将海水晶溶于已曝气48 h 的自来水（以下用水相同）中，用盐度计调整盐度至25，置光照培养箱中，28 ℃保存备用。

卤虫卵水化方法：取4 ℃暂存的卤虫卵200～500 枚，置于50 mL 烧杯中（烧杯中预先盛装约40 mL 曝气48 h 自来水，并分别于20、25、30、35、40 ℃（记为T20…T40）恒温水浴中水化处理，每个温度的水化持续的时间均分为5 组，分别为1、2、3、4、5 h（记为t1…t5），每个试验组均设3 个平行。

水化后卤虫卵的孵化：将水化后的卤虫卵，用28 ℃人工海水（盐度25）中冲洗2～3 次，置于培养皿中，并加入适量人工海水，于28 ℃光照培养箱中孵化（24 h 光照）。对照组不经水化处理，其余操作与试验组相同。

孵化效果观察：孵化初期，每小时显微观察1次，并记录卤虫伞期初次出现时间，至幼虫孵出后，每2 h 观察1 次，同时吸走幼虫并计数。孵化持续40 h，结束时计数卤虫卵总数。

孵化效率计算：试验孵化效率用孵化率和分时段孵化率表示，计算方法如下[15]：

1.3 数据分析

本试验中所有数据均以平均值±标准差表示，用SPSS 20.0 和Excel 2010 进行数据统计分析，进行单因素方差分析（one-way ANOVA），以P＜0.05表示显著。

2 结果分析

2.1 水化条件差异对卤虫卵总孵化率的影响

水化时间和温度对卤虫卵的总孵化率均存在一定影响（见表1）。试验选择的五个水化温度中，最高和最低温度时，无论水化时间长短，其卵的总孵化率均低于对照组，温度偏低时（T20），水化时间对总孵化率影响不大，且均低于对照组（79.57±0.07 %）；而T40时，总孵化率显著降低，甚至不及对照组的一半，最高仅为（54.25±0.03）%，水化时间越长，总孵化率越低。但是，T25～T35时，随着水化时间的延长，总孵化率有不断提高的趋势，特别是在t4以后，总孵化率明显高于对照组，最高时达到了（87.35±0.06）%（T35t5）。

2.2 不同水化条件对卤虫卵孵化时伞期和幼虫初始出现时间的影响

由表2 可知，T20～T35时卤虫孵化至伞期的时间随水化时间延长而缩短，t1～t5伞期出现的时间从11 h 缩短至6 h；但在T40时，呈现相反现象，且伞期出现时间从11 h 增加至19 h。非最高温度时，伞期出现时间相比对照组有不同程度提前，但是，结合水化本身所用时间，发现所用总时间与对照组（11 h）基本一致，即同温度条件下水化不同时间对出现伞期时间的影响较小。与伞期类似，T20～T35时，卤虫初始孵出时间随水化时间的增加而逐渐提前，相比于对照组（17 h）均有提前（表2）。而T40时初始孵出时间则随水化时间的增加而延迟，最终达到23 h。如果从开始水化计时，则除最高温度外，不同水化处理温度下，卤虫初始孵出时间均存在不同程度提前（0～4 h）的现象。

表2 不同水化方案处理后卤虫卵孵化中伞期和幼虫期初始出现时间 h

2.3 卤虫卵孵出时间受水化条件影响的结果

为了避免个体差异对卤幼开始孵出时间点造成的误差，将卤幼孵化过程中幼虫最初5%孵出的时间进行统计，同时，将95%幼虫孵出的时间确定为绝大部分孵出的时间（见表3）。从卤虫卵进入28 ℃正式孵化开始计算时间，除最高的试验温度（40 ℃）外，其余各组中最初5%幼虫和95%幼虫孵出的时间较对照组（19 h、29 h）均有明显缩短，最短达到11 h（T30t5）、24 h（T30t5）。但与开始出现伞期的时间规律类似，如果将水化时间与孵化时间累计，则水化过程对大部分幼虫孵出时间影响较小。采取最高的水化温度，则显著延长了大部分幼虫孵出时间，最长达到39 h（t5）。

表3 卤虫卵孵化完成5%、95%所用时间 h

为了更直观了解卤幼孵出时的数量变化趋势，将不同观察时间段的卤虫幼虫孵出情况用图1～图5 表示，试验组和对照组中幼体分时段孵化率呈类似正态分布。相较于对照组21 h 达到峰值（26.33±0.01）%，T20、T25时，峰值出现时间逐渐提前（0～3 h），但峰值点的幼体占比呈现先上升，从t2后开始下降的趋势。T30、T35时，峰值出现时间除T30t1外逐渐提前（1～7 h），且峰值孵化率也逐渐提高。较低温度下各组的最高峰值孵化率均略高于对照组。但是，T40时，峰值出现时间逐渐延迟，峰值孵化率也逐渐下降，且均偏低。

图1 20 ℃下水化不同时间后分时段孵化率

图2 25 ℃下水化不同时间后分时段孵化率

图3 30 ℃下水化不同时间后分时段孵化率

图4 35 ℃下水化不同时间后分时段孵化率

图5 40 ℃下水化不同时间后分时段孵化率

3 讨论

3.1 卤虫卵孵化前进行水化处理可以缩短孵出时间

卤虫是变温动物，其生长和繁殖必然受到外界环境温度的影响。与其他变温生物类似，在一定温度范围内随着环境温度的升高，卤虫的发育加快，而温度过高可能对卵内的组织造成一定程度的损坏，甚至可能出现死卵现象[16-17]。因此，温度界限对于人们科学利用卤虫卵孵化出的幼体或成体极为重要。

作者认为水化也是孵化过程的一部分（即当休眠卵接触水体开始，就被认为孵化启动），水化温度也必然与孵化进程密切相关。本试验中当水化温度在30 ℃及以下时，随着水化时间的延长，伞期和幼虫开始出现的时间均呈明显提前的趋势（孵化时间均低于对照组）。但35 ℃时，这种差异并不明显，水化时间持续在5 h 时，总的孵化时间与对照组相等（即没有促进作用）；而且，在40 ℃时甚至出现明显相反的结果（表2）。这一现象表明30～35 ℃可能是本试验卤虫卵水化处理的分界温度，当处理条件为30 ℃、5 h 时可以有效缩短孵化时间。

当然，不同品系的卤虫，其发育温度界限存在差异[18]：贾沁贤认为当温度超过30 ℃以上，卤虫（山西运城）的发育速度开始减缓[19]。因此，确定孵化温度时应当确认其温度界限。

利用含盐量极低的自来水进行卤虫的前期水化处理，可以加速卤虫的孵化进程，其原因是否与卤虫卵在低渗溶液中可以加快水的渗透，促进卵壳软化和有机物溶解而显现生物学活性有关，尚不得而知。

3.2 水化温度和时间的交互作用对卤虫孵化率存在一定影响

影响卤虫卵孵化的因素众多，虫卵质量和孵化环境条件影响最大，当然环境因子亦是通过影响卵发育来实现，在合适条件下的孵化过程，卤虫发育正常；而不适的条件则可能导致部分弱势胚胎发育停滞，或者影响胚胎发育过程，延长发育时间，也或者直接影响幼体质量，导致部分幼体不能破壳，从而改变孵化率。温度是重要的环境因子，合适的环境温度下，胚胎发育正常，但当温度较低时，胚胎发育时间延长，内营养供应有限，制约胚胎发育进程，从而影响胚胎质量。

孵化前期的水化过程同样也对孵化率产生影响。而在本试验中，水化温度为20 ℃时，孵化率均低于对照组，但温度上升至25～35 ℃时，孵化率不断上升，最高时显著超过对照组。

水化时间对孵化率的影响也较大。胡志杰等认为延长水化时间一定程度上有助于卤虫卵孵化率的提高[7]，杨娜等在用自来水浸泡处理卤虫卵时，发现25 ℃、3～4 h 的孵化率比短时间有所提高[20]。本试验中，除最高温度外，其余温度水化后的卤虫卵孵化率随时间延长均有增加的趋势。

相反，如果环境温度过高，细胞内基因表达图谱会改变，参与细胞正常功能的基因表达可能会受到抑制，对与卤虫孵化有关的酶造成影响，从而使孵化率下降。刘凤岐等认为在高温水中处理卤虫卵，会使卵迅速吸收水分，对卵有一定程度损伤[16]；贾沁贤等也发现卤虫在温度30 ℃后孵化率下降（从70.5%降至52.0%）[19]。本试验中，当水化温度达到40 ℃时，孵化率显著降低，甚至不及对照组的一半，最高仅为（54.25±0.03）%，而且水化时间越长，孵化率越低。

综合水化温度和水化时间两种因素的影响，在一定温度范围内，适当延长水化时间可以提高卤虫卵的孵化率。根据本试验的研究结果，使用曝气自来水，25 ℃、3 h 的水化方案，可以获得渤海湾卤虫卵较高的孵化率，同时还能适当缩短水化时间。