复合乳酸菌制剂对预防断奶仔猪细菌性腹泻及生长性能的影响

杜丽欣，张峰瑞，邹雪，韩慕蓉，张建斌，洪亮

（天津农学院 动物科学与动物医学学院 天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室，天津 300392）

在养猪业，断奶仔猪腹泻是最常见的疾病，仔猪断奶后由于食物和环境改变，其肠道屏障功能减弱、机体代谢和免疫力下降，可能会增加病原菌在肠道菌群的占比，从而引起腹泻，严重会导致仔猪死亡，继而给养殖户带来重大经济损失[1]。为了预防断奶仔猪腹泻，许多养殖户在饲料中添加抗生素。而抗生素的使用会破坏肠道菌群平衡并导致细菌产生耐药性[2]，给动物健康带来不利影响，甚至会残留在畜产品中，危害人体健康。国家农业农村部公告第194 号中规定从2020 年1 月1 日起实施全面“禁抗”，抗生素替代剂的研发引起畜牧业广泛关注。

通过关于替抗物质的大量研究，发现益生菌具有安全和不污染环境等优点[3]，可以解决细菌耐药性和药物残留的问题，增加宿主肠道中有益微生物的数量并促进动物肠道健康[4]。因此，益生菌作为饲料添加剂被广泛应用于畜牧业。有研究表明，乳酸菌在促进营养物质吸收和增强机体免疫力方面有一定作用[5]，且能与肠道病原菌竞争定殖使肠道微生物群达到平衡。因此，乳酸菌被广泛应用于改善断奶仔猪应激现象[6]。乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是最主要的饲用益生菌之一[7]，其为革兰氏阳性菌，呈过氧化氢酶阴性，主要包括乳杆菌属、乳球菌属、双歧杆菌属、链球菌属和肠球菌属等。

随着对饲料中添加单一乳酸菌的研究越来越多，有研究表明LP 和LR 对肠道病原菌有竞争抑制、刺激宿主免疫系统、改善仔猪早期肠道屏障功能、有效预防腹泻等作用[8-9]。为了寻求效果更好的乳酸菌添加剂，越来越多关于复合乳酸菌作为饲料添加剂的研究开始出现[10]。本试验旨在将LP 与LR 复合乳酸菌制剂作为替抗饲料添加剂，探究肠道乳酸菌与大肠型细菌是否有竞争关系，评估其在预防断奶仔猪细菌性腹泻方面的效果，以期为复合乳酸菌制剂的应用提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验乳酸菌：试验用LP 和LR 均分离于健康仔猪粪便，纯化后保存于天津农学院动物营养实验室。

复合菌：培养LP 和LR 的单一菌落至对数生长期，乳酸菌培养液以4 000 r/min 离心15 min，去其上清液后称重，添加（W/V）10%脱脂牛奶后进行冷冻干燥。0～14 d 在基础日粮中添加复合乳酸菌制剂1×109CFU/kg，占饲料重0.1%，15～28 d 添加量减半，为5×108CFU/kg，占饲料重0.05%。

1.2 试验动物及试验设计

本试验于天津强源康农业科技有限公司附属猪场进行，选取12 头28 日龄断奶平均初始体重为（6.77±1.30）kg 的三元仔猪。根据初始体重均衡的原则将其分成2 组，为对照组和试验组，每组6 个重复，每个重复1 头猪。对照组饲喂基础日粮，试验组饲喂添加复合LAB 制剂的基础日粮。

1.3 基础日粮与饲养管理

试验中所用的基础日粮为天津胜腾饲料有限公司生产，表1 为饲料营养成分。试验前对猪舍进行彻底清扫消毒，并空栏7 d。试验期间，猪舍进行全封闭式管理，保持猪舍卫生、通风、干燥。温度控制在25～27 ℃。对照组和试验组同舍饲养，分别饲养于两栏中，通过耳标进行个体识别，自由采食与饮水。每天定时观察仔猪的情况并记录其腹泻的相关数据，试验期共28 d。

表1 仔猪基础日粮的营养成分表 %

1.4 测定指标与方法

1.4.1 生长性能

每头猪在0 d、7 d、14 d、21 d 和28 d 空腹称重，记录每天采食量，分别计算对照组和试验组0～14 d、15～28 d、0～28 d 平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和饲料转化率（FCR）。

1.4.2 肠道LAB 以及大肠型细菌测定

在14 d 和28 d 早上采集每头猪的新鲜粪便，分别放在有编号的塑料袋中，保存在有冷冻冰的泡沫箱中，立即送到实验室进行微生物计数。称取适量粪样于2 ml 离心管中，用1 ml 蒸馏水稀释，依次稀释四个梯度10-1～10-4，分别取0.01 mL 接种于MRS 琼脂培养基和麦康凯培养基上，每个稀释度3 个重复，37 ℃培养20 h 后进行计数。菌落的数量以每克鲜猪粪样中所含微生物的对数值（log）表示（CFU/g）。

1.4.3 腹泻指标

试验通过粪便指数、腹泻率和腹泻指数三个指数表示仔猪腹泻情况。

粪便指数：0 分-正常粪便（固体）；1 分-湿粪（半固体）；3 分-稀便（轻度腹泻）；5 分-水样粪便（严重腹泻）。轻度腹泻和重度腹泻均视为腹泻。

腹泻率和腹泻指数的计算方式如下。

腹泻率：腹泻的天数/总试验天数

腹泻指数：总粪便指数/总试验天数[11]

1.5 数据分析与处理

试验数据用Excel 软件进行处理后，采用GraphPad Prism 软件进行t 检验分析，结果用平均值±标准差表示。P＞0.05 表示差异不显著，P＜0.05 为具有显著性差异，P＜0.01 为具有极显著性差异。通过最小二乘法求14 d 和28 d 仔猪的体重和ADG与肠道LAB 的回归方程，并进行相关性分析。

2 结果

2.1 复合LAB 对断奶仔猪生长性能的影响

通过表2 可知对照组和试验组断奶仔猪的平均体重差距逐渐增大。试验期结束时与对照组相比，饲喂复合LAB 断奶仔猪的平均体重增加了1.84 kg。0 d 时，试验组的断奶仔猪体重最小值小于对照组体重最小值，14 d 时，试验组断奶仔猪体重最小值与对照组接近，21 d 时，试验组的断奶仔猪体重最小值超过对照组。表明在基础日粮中添加复合LAB 后，提高了断奶仔猪的生长性能，体重增加更快。与对照组相比，试验组的断奶仔猪采食量增加（P＞0.05），FCR有所降低（P＞0.05）。表明在基础日粮中添加复合LAB 可提高断奶仔猪的采食量并改善其FCR。

表2 对照组及试验组断奶仔猪每周体重与前两周、后两周和试验期平均日增重、平均日采食量、饲料转换率差异显著性分析

2.2 复合LAB 对断奶仔猪肠道LAB 以及大肠型细菌的影响

图1 中，饲喂复合LAB 两周后的断奶仔猪肠道菌群中LAB 数量与对照组相比显著增多（P＜0.01），大肠型细菌数量明显减少（P＞0.05），但无显著性差异；饲喂复合LAB 四周后的断奶仔猪肠道菌群中的LAB 和大肠型细菌数量与对照组相比差异均显著（P＜0.05）。图2 中，与对照组相比，饲喂复合LAB 两周后（A）和四周后（B）的断奶仔猪肠道LAB 与大肠型细菌数量比率均有显著性差异。饲喂复合LAB 的断奶仔猪肠道LAB 与大肠型细菌数量比率显著增加，表明饲料中添加复合LAB 能有效减少大肠型细菌数量，肠道LAB对大肠型细菌竞争抑制作用增强，肠道病原菌被更有效抑制。

图1 对照组与试验组断奶仔猪肠道LAB数与大肠型细菌数差异显著性分析

图2 对照组与试验组断奶仔猪肠道LAB 与大肠型细菌的比率

2.3 复合LAB 对断奶仔猪腹泻相关指标的影响

表3 中，与对照组相比，试验组的断奶仔猪在前两周的粪便指数、腹泻率和腹泻指数均显著下降（P＜0.05），在后两周，其腹泻相关指标下降不明显（P＞0.05）。但在表3 及图3 中可以看到饲喂复合LAB 的断奶仔猪在整个试验期的腹泻相关指标与对照组相比显著下降（P＜0.05）。表明在饲料中添加复合LAB 可有效减少腹泻相关指标。且前两周饲料中复合LAB添加量为109CFU/kg时，对腹泻相关指标的改善明显优于后两周添加量为5×108CFU/kg 时的效果。表明在饲料中添加复合LAB的量为109CFU/kg 时对预防断奶仔猪腹泻效果更好。

表3 0～14 d，15～28 d，0～28 d 对照组及试验组断奶仔猪粪便指数、腹泻率（%）、腹泻指数差异显著性分析

2.4 体重与ADG 及肠道LAB 数量相关性分析

图4 中，饲喂复合LAB 四周后断奶仔猪体重与肠道LAB 数量的相关性（R2＝0.377 8，P＜0.000 1）比饲喂复合LAB 两周后的相关程度（R2＝0.218 0，P＝0.004 1）更高。图5 中，与饲喂复合LAB 四周后相比（R2＝0.233 8，P＝0.002 8），饲喂复合LAB 前两周断奶仔猪平均日增重与肠道LAB 数量的相关程度（R2＝0.443 2，P＜0.000 1）更高。图4、图5 中，断奶仔猪平均日增重与肠道LAB 数量呈正相关。

图4 对照组与试验组断奶仔猪体重与LAB 活细胞数的相关性分析图

图5 对照组与试验组断奶仔猪平均日增重与LAB 活细胞数的相关性图

3 讨论

3.1 复合LAB 对断奶仔猪生长性能的影响及体重、ADG 与肠道LAB 数量相关性分析

LAB 有助于增强肠道屏障，防止病原菌感染破坏，且能维持代谢稳态，增强宿主免疫系统，从而对断奶仔猪的生长性能和健康有促进作用。LR 进入肠道会产生乳酸、蛋白酶及细菌素等代谢产物，可以显著提高绒毛高度，促进杯状细胞增殖与黏蛋白分泌，从而促进受损的小肠上皮细胞修复，同时增加小肠对营养素的吸收面积[12]，促进仔猪生长，所以肠道LAB 数量与断奶仔猪体重及ADG呈正相关。杨阳等[13]研究表明，饲料中添加枯草芽孢杆菌和乳酸菌显著提高了断奶仔猪平均日增重，WANG 等[14]在饲料中添加丁羧酸菌和粪肠球菌显著提高了断奶仔猪体重，显著降低FCR，提高仔猪生长性能，与本试验一致。而ZHAO等[15]认为饲料中添加LP 和LR 复合制剂对断奶仔猪ADFI没有影响，所以不同LAB 添加量可能是影响ADFI的重要因素。陈月茹等[16]研究了枯草芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌三者复合的益生菌，按质量比添加3.0‰复合益生菌，断奶仔猪体重增加显著高于添加2.0‰和1.0‰的试验组，生长性能提高。为了探究复合LAB 添加量对断奶仔猪生长性能和肠道LAB 数的影响，试验设计在后两周将饲料添加剂的量减半为5×108CFU/kg，结果显示虽然在后两周减少了复合LAB 的量，但断奶仔猪肠道LAB 数量维持在一定水平，同样促进了其生长性能。关于在断奶仔猪生长后期减少饲料中复合LAB 的添加量同时维持断奶仔猪生长水平的深入研究可以为养殖场节约成本作为参考。

3.2 复合LAB 对断奶仔猪肠道微生物及腹泻相关指标的影响

仔猪断奶腹泻主要由条件致病菌和肠毒素引起，而最常见的是由于仔猪肠道微生物组成平衡被破坏，导致生长缓慢，条件致病菌更容易定殖在肠道内诱导炎症。LAB 产生的丁酸可以通过减轻炎症反应来缓解腹泻，其机理是丁酸通过降低促炎细胞因子TNF-α、IFN-γ 等表达和增加抗炎细胞因子TGF-β 表达来减轻炎症反应，还可以增强肠道粘膜机械屏障功能，改善肠道菌群结构，从而降低仔猪腹泻相关指标[17]。丁爽等[18]的研究中，添加屎肠球菌B13 的断奶仔猪粪便中乳酸菌及屎肠球菌数量较对照组显著增加，且大肠杆菌数量有下降趋势。引起仔猪腹泻的主要致病菌是大肠杆菌和沙门氏菌[19]，均属于大肠型细菌。因此，本试验对肠道大肠型细菌进行计数间接表示肠道致病菌的定殖情况。HE 等[20]试验中用约氏乳杆菌L531 饲喂断奶仔猪，肠道沙门氏菌数量显著降低，WANG 等[8]研究结果表明饲喂LP 断奶仔猪的相关腹泻指标降低，与本试验结果一致。

前两周复合LAB 在饲料中的添加量为109CFU/kg，是后两周的两倍，以期达到前两周预防仔猪腹泻和后两周维持预防作用的效果。结果显示与对照组相比，后两周添加量减半时，仔猪腹泻相关指数虽然不像前两周有显著性差异，但预防腹泻的效果在前两周的基础上有维持。

3.3 肠道LAB 与大肠型细菌比率变化

仔猪断奶后由于环境和饮食改变，肠道微生物平衡被破坏，有些病原微生物可能会定殖于肠道内，但部分微生物会展现出一定的竞争优势，比如LAB，其主要作用机制包括增强肠道上皮屏障，增加肠道黏膜的粘附作用，同时抑制病原微生物黏附，与病原微生物竞争定殖[21]。研究证实LAB 黏附于Caco-2 和IPEC-J2 细胞上与病原微生物竞争黏附位点的作用机制可能是钙促进细胞表面与蛋白质和多糖黏附蛋白分子的特异性黏附作用[22]。同时，LAB 可以调控肠上皮细胞产生炎性因子从而发挥抗炎作用，LR 通过抑制IPEC-J2 分泌白细胞介素-8（IL-8）从而抑制脂多糖（LPS）诱导产生的炎症反应[23-24]。DELL 等[25]研究中复合LAB 作为饲料添加剂饲喂断奶仔猪，增加有益微生物菌群相对丰度，其机制可能是LR 促进肠道内丁酸产生，梭菌XIVa 群增殖，从而提高短链脂肪酸含量，因为梭菌XIVa 群具有黏附黏蛋白的活性，可以减少肠道内致病菌对黏蛋白的利用[12]。

试验中计算分析肠道LAB 与大肠型细菌比率后，发现饲喂添加复合饲料的断奶仔猪肠道中大肠型细菌占比减少，肠道LAB 占比增加。这表明在饲料中添加复合LAB 可以抑制肠道大肠型细菌等病原微生物生长。

3.4 复合LAB 是否具有协同作用

在一种复合益生菌中，可能会因为拮抗作用或竞争结合位点导致其作用效果减弱，也可能除了发挥单个益生菌的菌株特性，还与其他益生菌通过协同作用发挥更广泛的抑菌效果[26]。因此，在复合LAB 的研究中，除了对复合LAB 与肠道病原菌是否具有拮抗作用的研究以外，复合LAB 进入肠道是否能发挥协同作用也是研究的关键。与单个乳酸菌相比，具有协同作用的复合LAB 会更好地促进其刺激宿主免疫系统、改善仔猪肠道屏障等功能，从而有效预防仔猪腹泻。王汉星[27]研究表明，枯草芽孢杆菌与粪肠球菌在饲粮中单独添加会显著促进仔猪肠道发育并提高氨基酸消化率，而枯草芽孢杆菌与粪肠球菌混合添加对提高仔猪的生长性能、肠道发育以及氨基酸消化率有相互促进作用。本试验中在饲料中添加复合乳酸菌制剂同样提高了仔猪的生长性能，对预防断奶仔猪腹泻有良好的效果。与王汉星[27]的研究结果一致。

4 结论

综上所述，饲料中添加LP 和LR 复合制剂可加快断奶仔猪体重增长，增加断奶仔猪采食量，并改善其饲料转化率。LP 和LR 通过抑制肠道病原微生物生长，有效降低了仔猪腹泻相关指标。