铜绿微囊藻与拟新月藻和四尾栅藻的竞争及化感作用初探

陈璇，张达娟，张树林，王泽斌，戴伟，毕相东

（天津农学院 水产学院 天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300392）

所谓种间竞争，就是两种或两种以上的生物，为了争夺生活空间、资源等，对彼此进行直接或间接的压制现象[1]。利用性竞争和干扰性竞争可以作为生物对资源获取的两种方式[2]，利用性竞争是指在资源和环境受限的情况下，由于资源短缺，生物与其他竞争者之间会产生影响生长的一种间接性的竞争行为，张坤等[3]研究发现由于水体中资源和空间的限制，微藻间会出现相互抑制。干扰性竞争为一种生物借助行为排斥其竞争者，使其无法得到资源而死亡，其行为机理多种多样[2]，化感作用是干扰性竞争的一种，大量的研究证明种间竞争对藻类群落的多样性与稳定性形成具有决定性作用[4-5]，而化感作用作为藻类种间竞争的重要手段对藻类群落的形成也具有重要作用。

“化感作用”一词是奥地利科学家莫利斯在1937 年提出来的，它是指一种植物包括微生物通过将化合物释放到环境中来抑制或促进其他植物包括微生物生长[6]。INDERJIT 等[7]认为藻类胞外细胞分泌的产物不只作用于本身，而且还能作用于周围环境中的其他藻类，或通过作用于某些营养盐离子聚集而扰乱其他藻类营养盐吸收利用。有研究发现[8]，小定鞭金藻（Prymnesium parvum）的暴发时间大概在蓝藻赤潮之前和硅藻赤潮之后，这一定程度上说明蓝藻受小定鞭金藻滤液的影响比硅藻小，小定鞭金藻的化感作用使群落结构由硅藻向蓝藻演变，说明化感作用在生态系统内部群落结构变化中扮演了重要角色。孙春蕾[9]研究发现，滤液培养体积为 50%时的水华鱼腥藻（Anabaena flos-aquae）对铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）有一定的促进作用，而滤液培养体积为 100%时则会抑制铜绿微囊藻生长；而在TAMEISHI 等[10]的试验研究中也发现，高密度的微型原甲藻（Prorocentrum minimum）培养滤液对中肋骨条藻（Skeletonema costatum）的生长起到抑制作用，低密度的滤液则相反；HARRIS 等[11]研究发现，实球藻（Pandorina morum）滤液会使球团藻（Volvox globator）的光合作用呈下降状态。徐文静等[12]研究表明，新月菱形藻（Cylindrotheca closterium）滤液对东海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）生长有强烈的抑制作用，导致叶绿素受到破坏，光合系统受损，最终细胞无法繁殖直至死亡。

近年来，湖泊富营养化导致的水华等环境问题日益加剧，浮游藻类间化感作用和种间竞争的研究也逐渐增多。铜绿微囊藻是造成水华最重要的蓝藻种，铜绿微囊藻能够产生毒性很强的微囊藻毒素，不仅会影响生活于水中的生物，而且会通过食物链传递威胁人类健康[13]。拟新月藻（Closteriopsis longissima）和四尾栅藻（Scenedesmus quadricauda）都属于适应性强且能够稳定生长的有益绿藻，其中关于拟新月藻的研究较少，本研究以铜绿微囊藻FACHB 905、拟新月藻和四尾栅藻为试验对象，通过共培养和滤液培养两种方法，探究铜绿微囊藻和两种绿藻间的种间竞争及化感作用，为进一步了解铜绿微囊藻暴发机制积累基础数据。

1 材料与方法

1.1 藻种培养

试验所用铜绿微囊藻FACHB 905、拟新月藻和四尾栅藻均来源于天津农学院水产生态及养殖重点实验室。使用BG11 培养基于光照培养箱中进行培养，条件如下：温度（25±1）℃，光照强度4 000 lx，光暗比（L∶D）12 h∶12 h。

1.2 试验设计

混合培养试验：设置单培养组铜绿微囊藻（A组），拟新月藻（B 组）和四尾栅藻（C 组），2 种藻类混合培养组铜绿微囊藻＋拟新月藻（D 组）和铜绿微囊藻＋四尾栅藻（E 组），3 种藻类混合培养组铜绿微囊藻＋拟新月藻＋四尾栅藻（F 组）。3 种藻接种密度均为1×106cell/mL，培养体积为100 mL，每组设置3 个平行，试验条件与藻种培养条件相同。每2 d 取样，计数细胞密度。

滤液培养试验：铜绿微囊藻、拟新月藻和四尾栅藻分别单独培养于BG11 培养基中，作为对照组，初始藻细胞密度同混合培养试验一致。将3种藻分别在BG11 培养基中培养15 d 后，通过离心和抽滤获得不含藻细胞的滤液。试验处理组设置：C（M）为用拟新月藻滤液培养铜绿微囊藻，S（M）为用四尾栅藻滤液培养铜绿微囊藻。滤液占比设为50%和100%，培养体积为100 mL，每组设置3个平行，试验条件与藻种培养条件相同。每2 d 分别取样，计数藻细胞密度并测定藻类PSⅡ的最大光能转化效率（Fv/Fm）。

1.3 试验方法

藻细胞计数：用血球计数板在显微镜下进行计数，平行计数3 次，取其平均值，分别计算每种藻类的细胞密度。

叶绿素荧光参数测定：用叶绿素荧光测定仪（Phyto-PAM，Walz，德国）对三种藻进行叶绿素荧光参数测定。取2 mL 混合均匀的藻液，暗适应5 min 后打开测量光进行如下检测：

其中，F0表示初始荧光（minimal fluorescence），Fm为最大荧光（maxima fluorescence）。

1.4 生长曲线拟合及拐点确定

以logistic 方程拟合藻类的生长过程。以每个处理组的最大藻细胞密度（Xmax）作为各自K的估计值。 应用 logistic[14]方程的对数形式，对各单独培养组藻拐点前的生长情况以最小二乘法进行回归分析，获得该方程的斜率和截距作为a和r的估计值。

在我国的人均淡水资源仅占据世界人均的四分之一，据相关调查研究，预计2025年，世界中的缺水人口数量将会达到30亿[2]，40个国家或地区会出现淡水严重供给不足的情况。人类的可利用淡水资源占据地球水资源的比例可见图1.由于水污染与污染肆意排放的问题日益加重，对人们的生活与生态环境产生的恶劣影响。因此利用污水处理与回收技术，才能加强生态城市的建设水平。从目前情况来看，可以利用集中处理与分散处理两种技术，将两种技术互相结合，可以逐步形成点、面、区域三个层次的中水回收循环利用系统，从而加强城市中的水资源利用效率，避免水资源浪费。

对混合培养的藻类进行logistic 方程拟合后，获得a值和r值，拐点由得到，tp取整数[14]。

1.5 竞争抑制参数计算

两种藻类混合培养时，利用Lotka-Volterra[15]竞争模式的差分形式[式（2）、（3）]计算：

式中：Nmn和Nnn为微藻m、n（m、n 表示三种微藻中的2 种）在tn时的密度（×106cells/mL），Nmn-1和Nnn-1分别为微藻m、n 在tn-1时的密度（×106cells/mL），rm和rn为微藻m 和n 的增长率（单独培养由logistic 方程计算获得），Km和Kn为微藻m、n 单培养时的最大环境容量，α为微藻m 对微藻n 的竞争抑制参数，β为微藻n 对微藻m 的竞争抑制参数。

三种藻混合培养时，利用Lotka-Volterra 竞争模式的差分形式[式（4）、（5）、（6）]计算：

式中Nxn、Nyn和Nzn分别为铜绿微囊藻、拟新月藻和四尾栅藻在tn时的密度（×106cells/mL）；Nxn-1、Nyn-1和Nzn-1分别为铜绿微囊藻、拟新月藻和四尾栅藻在tn-1时的密度（×106cells/mL）；rx、ry和rz分别为铜绿微囊藻、拟新月藻和四尾栅藻的增长率；Kx、Ky和Kz分别为铜绿微囊藻、拟新月藻和四尾栅藻单培养时的最大环境容量；αxy、αyx、αxz、αzx、αyz和αzy分别为拟新月藻对铜绿微囊藻、铜绿微囊藻对拟新月藻、四尾栅藻对铜绿微囊藻、铜绿微囊藻对四尾栅藻、四尾栅藻对拟新月藻和拟新月藻对四尾栅藻的竞争抑制参数。三种藻类的竞争抑制参数由式（4）、（5）、（6）利用最小二乘法估算。

1.6 数据处理与分析

利用Excel 2010 对试验数据进行整理并作图。用统计软件origin 2018 拟合logistic 方程。用SPSS 17.0 软件进行统计分析。

2 试验结果

2.1 混合培养对藻类生长的影响

铜绿微囊藻单独培养及其与拟新月藻、四尾栅藻混合培养的生长曲线如图1 所示，试验前2 d，混合培养（D 组、E 组、F 组）与单培养中铜绿微囊藻的细胞密度无显著性差异（P＞0.05），从第四天开始，混合培养中铜绿微囊藻的细胞密度均显著低于单培养组（P＜0.05），表明混合培养下铜绿微囊藻的生长受到明显抑制。

图1 铜绿微囊藻单培养和混合培养下的生长

将铜绿微囊藻的单独培养与拟新月藻、四尾栅藻混合培养生长过程，进行逻辑斯谛方程的参数估计，由表1 可以看出，铜绿微囊藻单独培养时最大环境容量（K）为9.7×106cell/mL，混合培养（D 组、E 组、F 组）时铜绿微囊藻的最大环境容量分别为2.92×106cell/mL、3.62×106cell/mL、1.97×106cell/mL，分别为单独培养K值的30.1%、37.4%、20.3%；混合培养铜绿微囊藻的生长率r值分别为单独培养时r值的46.4%、64.3%、25.0%，由此可以看出在混合培养时铜绿微囊藻的生长均受到抑制，其中三种藻类混合培养对铜绿微囊藻生长的抑制作用最强，拟新月藻对铜绿微囊藻生长的抑制作用强于四尾栅藻对铜绿微囊藻生长的抑制作用。

表1 铜绿微囊藻的单培养及混合培养参数 106 cells·mL-1

2.1.2 混合培养时的竞争抑制参数

铜绿微囊藻与拟新月藻、四尾栅藻分别混合培养时的竞争抑制参数的变化如表2 所示，混合培养时的前两天均不存在竞争关系。D 组中从第四天开始拟新月藻对铜绿微囊藻的生长产生竞争抑制，铜绿微囊藻对拟新月藻则在第六天产生竞争抑制且竞争抑制参数在逐渐减小。拟新月藻对铜绿微囊藻的平均竞争抑制参数为2.7，其相反平均抑制参数为0.5，可以得知拟新月藻对铜绿微囊藻的抑制作用较强。E 组中，第四至六天时，四尾栅藻对铜绿微囊藻的抑制作用最大，从第八天开始，铜绿微囊藻对四尾栅藻产生抑制作用，四尾栅藻对铜绿微囊藻的抑制作用变弱。在8～14 d时，铜绿微囊藻对四尾栅藻的抑制参数逐渐增大，铜绿微囊藻对四尾栅藻的平均竞争抑制参数为4.8，四尾栅藻对铜绿微囊藻的平均抑制参数为1.5，铜绿微囊藻对四尾栅藻的平均抑制参数是其相反抑制参数的3.1 倍。

表2 铜绿微囊藻与四尾栅藻、拟新月藻分别混合培养时竞争抑制参数的变化

铜绿微囊藻与拟新月藻、四尾栅藻混合培养时竞争抑制参数由表3 所示，拟新月藻对铜绿微囊藻的平均竞争抑制参数是其相反平均抑制参数的1.7 倍，铜绿微囊藻对四尾栅藻的平均竞争抑制参数是其相反平均抑制参数的3.6 倍。

表3 三种藻混合培养时的竞争抑制参数

与表2 的参数进行对比，D 组拟新月藻对铜绿微囊藻的平均抑制参数与F 组的基本保持一致，铜绿微囊藻对拟新月藻的平均抑制参数F 组是D组的3.3 倍，F 组的四尾栅藻对铜绿微囊藻的平均抑制参数是E 组的7.1 倍，铜绿微囊藻对拟新月藻的平均抑制参数F 组是E 组的8.4 倍。

2.2 滤液培养对铜绿微囊藻生长及PSⅡ的最大光能转化效率（Fv/Fm）的影响

2.2.1 滤液培养对铜绿微囊藻生长的影响

BG11 培养基纯培养和添加拟新月藻滤液对铜绿微囊藻的生长情况见图2，结果表明，添加拟新月藻滤液后从第八天开始对铜绿微囊藻细胞密度产生显著影响（P＜0.05），50%C（M）组的细胞密度得到显著的促进作用（P＜0.05），而100%滤液组则相反（P＜0.05）。但至12 d 开始，50%和100%滤液组的铜绿微囊藻细胞密度均呈下降趋势，至试验结束时，对照组、50%和100%滤液组的细胞密度分别为9.20×106cell/mL、4.82×106cell/mL 和3.03×106cell/mL，50%和100%滤液组的细胞密度分别占对照组细胞密度的52%和33%，添加滤液组显著低于对照组（P＜0.05）。

图2 拟新月藻滤液培养对铜绿微囊藻细胞密度的影响

由图3 可知，四尾栅藻滤液从第四天开始对铜绿微囊藻细胞密度产生显著的抑制作用（P＜0.05），50%和100%S（M）组的细胞密度在前6 d无明显差异（P＞0.05），至试验结束，100%S（M）组的细胞密度始终低于50%滤液组，且显著低于对照组（P＜0.05），50%和100%S（M）组的细胞密度分别为5.04×106cell/mL 和2.27×106cell/mL，分别仅占对照组细胞密度的55%和25%。

图3 四尾栅藻滤液培养对铜绿微囊藻细胞密度的影响

2.2.2 滤液培养对铜绿微囊藻PSⅡ的最大光能转化效率（Fv/Fm）的影响

如图4 所示，50%C（M）组Fv/Fm仅第六天时显著高于对照组（P＜0.05），其余时间与对照组无显著性差异（P＞0.05）。100%C（M）组Fv/Fm则从第八天开始显著低于对照组（P＜0.05），到试验结束时，100%C（M）组Fv/Fm的值较对照组下降了15%，表明100%拟新月藻滤液的加入对铜绿微囊藻光合系统Ⅱ造成不利影响。同时发现在试验后期，50%S（M）组和100%S（M）组Fv/Fm的值有显著差异（P＜0.05）。四尾栅藻滤液对铜绿微囊藻Fv/Fm的影响与C（M）组相似（图5）。

图4 拟新月藻藻滤液培养对铜绿微囊藻在最大光合效率（Fv/Fm）的影响

图5 四尾栅藻滤液培养对铜绿微囊藻在最大光合效率（Fv/Fm）的影响

3 讨论

3.1 混合培养对三种藻类间竞争的影响

藻类通过对营养盐、光照等资源的竞争，可以分泌出一些物质直接或间接影响其他藻类种群的生长[16]。两种藻类混合培养时，拟新月藻对铜绿微囊藻的抑制作用在第二天开始，而其相反抑制作用在第四天开始，这可能是因为，拟新月藻的细胞体积远远大于铜绿微囊藻，所以先于铜绿微囊藻吸收更多的营养和光照，获取所需的生长条件，占据了优势地位。但在试验后期，由于拟新月藻的细胞过大和空间限制，长到一定程度之后无法继续生长，所以拟新月藻的内禀增长率会小于铜绿微囊藻。虽然拟新月藻不能成为优势种，但对铜绿微囊藻还有一定的抑制作用。四尾栅藻对铜绿微囊藻的抑制作用在第二天开始，而其相反抑制作用在第六天开始，可能是因为铜绿微囊藻不能快速适应环境，不能迅速生长。但在试验后期，铜绿微囊藻适应了环境，铜绿微囊藻对四尾栅藻的抑制作用远远大于其相反作用。铜绿微囊藻散发的毒性抑制了四尾栅藻的生长可能是其抑制作用大于四尾栅藻的原因之一[17]。表2 显示，两种绿藻对铜绿微囊藻的抑制作用开始较早，铜绿微囊藻对绿藻则靠后，这可能是因为培养的前几天微囊藻正在进行毒素的累积，有研究表明铜绿微囊藻细胞外毒素随生物量的增加缓慢上升[18]，所以等微囊藻毒素达到一定量时就会对绿藻产生抑制作用。

三种藻混合培养时，铜绿微囊藻的最大环境容量（K）和生长速率（r）均低于单培养和两种藻混合培养，这说明三种藻共培养时铜绿微囊藻受到的竞争抑制最强，但杨佩昀[19]在研究铜绿微囊藻、小球藻（Chlorella vulgaris）和小环藻（Cyclotellasp.）三种藻的竞争中发现，三种藻混合培养时铜绿微囊藻的生长速率最大，竞争力最强，这与本试验的研究结果不太一致，可能是因为藻种的不同，所以产生的抑制效果也不大相同。有研究表明，在特定的条件下，不同微藻能保持稳定共存的状态[20]。所以猜测三种藻混合培养时，两种绿藻保持稳定的状态占据大量的空间，从而对铜绿微囊藻产生更强的竞争抑制作用。但本试验主要探讨两种绿藻与铜绿微囊藻之间的竞争作用，所以对两种绿藻间的竞争作用还有待进一步研究。拟新月藻对铜绿微囊藻的平均竞争抑制参数是其相反平均抑制参数的1.7 倍，铜绿微囊藻对四尾栅藻的平均竞争抑制参数是其相反平均抑制参数的3.6 倍，这与三种藻类两两混合培养时的情况保持一致。由此可见，三种藻共培养时，其平均竞争抑制参数大小为：铜绿微囊藻＜拟新月藻，铜绿微囊藻＞四尾栅藻。

3.2 滤液培养对三种藻类化感作用的影响

Fv/Fm是藻类光合作用光系统Ⅱ的最大光化学量子产量，反映PSⅡ的内禀光能转化效率，或称PSⅡ的最大光能转化效率[21]。一般情况下，Fv/Fm比较稳定，不受物种和生长条件的影响，但在胁迫条件下会明显下降。本研究中，当拟新月藻和四尾栅藻滤液占比为50%时，铜绿微囊藻的Fv/Fm基本上与对照组无明显差异。当其滤液占比100%时，在试验的第八天开始，其Fv/Fm均出现显著下降，直至试验结束也没有恢复到正常水平，这期间藻类细胞密度也是逐渐降低，说明PSⅡ已经受到损害，导致藻细胞无法继续正常光合作用，进而抑制铜绿微囊藻生长[22]。

不同微藻间的化感作用效应存在差异，且随着藻类滤液浓度增加而增强[23]。朱小琴等[24]研究表明，生物碱类化感物质的对铜绿微囊藻的抑制作用随着剂量升高而逐渐升高，化感抑制作用强度与化感物质的浓度密切相关。杨佳[25]指出，只有当一种藻的起始密度足够高，使其分泌的化感物质在培养液中达到一定浓度时，才能对另一种藻产生明显的抑制作用。本试验中，随着培养时间延长，100%四尾栅藻滤液组的细胞密度均小于50%滤液组，表明添加100%四尾栅藻滤液对铜绿微囊藻的抑制作用更加显著。虽然对化感作用的研究重点一般是抑制作用，但促进作用也是会发生的，浦寅芳等[26]研究发现，只要球等鞭金藻（Isochrysis galbana）滤液的浓度不超过80%，就会对纤细角毛藻（Chaetoceros gracilis）的生长有明显的促进作用。有研究也表明，“低促高抑”现象在微藻间较为常见[27]，因为化感物质有不同的特性，所以不同藻类滤液分泌的某些胞外物质在不同的时间段或不同的浓度时会表现出不同的效应。这就解释了为什么50%拟新月藻滤液在8～10 d 时对铜绿微囊藻为促进作用，随后又被抑制，但其化感物质的具体构成和机制机理等还需进一步研究和分析。滤液培养试验中拟新月藻滤液对铜绿微囊藻的抑制作用是从第八天开始，而在混合培养试验中铜绿微囊藻则在第四天就受到拟新月藻的抑制，这说明拟新月藻对铜绿微囊藻的竞争作用强于化感作用。

4 结论

混合培养试验中，铜绿微囊藻的生长均受到抑制，其中三种藻类混合培养对铜绿微囊藻生长的抑制作用最强，拟新月藻对铜绿微囊藻生长的抑制作用强于四尾栅藻对铜绿微囊藻生长的抑制作用。滤液培养试验中，拟新月藻和四尾栅藻滤液对铜绿微囊藻有明显的化感抑制作用，滤液浓度越高，铜绿微囊藻的细胞密度和光合作用受到的抑制和胁迫效应越强。