柚皮精油提取工艺及抗氧化抑菌活性研究

李 西，姜 凯，黄爱妮，王 琴，张泽英，严碧云*

（1.武昌工学院食品健康研究所，湖北武汉 430065；2.武汉大学人民医院，湖北武汉 430065）

柚子（Citrus maxima）是芸香科柑橘属植物柚的果实，是最常食用的水果之一，2022 年中国的柚子年产量高达5.16×106t，居世界首位[1]。除了作为食用水果外，柚子通常被加工成果汁、饮料和罐头，在食用和加工过程中会产生大量的柚子皮，约占其鲜质量的50%，如果不及时处理会腐烂，造成环境污染与资源浪费。新鲜的柚子皮营养丰富，含有多种功能性化合物，如果胶、膳食纤维和精油等[2-3]，具有较好的抗氧化[2]、抗肿瘤[3]、抑菌[4]、降压[5]、降血糖[6]和延缓衰老[7]等功效。

植物精油是指采用压榨、萃取、蒸馏等方法从植物的各个部位提取的具有特殊香气和一定挥发性的油状物质[8]。国内外关于柚皮精油的提取方法较多，如水蒸气蒸馏法、溶剂萃取法、压榨法、微波辐射法、超声波提取法、超临界萃取等[9-11]，不同种类柚果体积差异较大，因而柚皮精油的提取方法也有较大不同，随着微波技术、超声波技术在食品、化工领域的发展和应用，其高效、短时、节能的优点受到青睐[12-13]。本研究以柚皮为原料，将微波、超声波与有机溶剂萃取法相结合提取柚皮精油，并对其进行抗氧化和抑菌性能研究，为进一步利用柚皮精油开发生物保鲜剂、抗氧化剂等提供理论支持，也可有效解决柚皮堆积造成的资源浪费和环境污染问题，从而提高柚子的附加值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

沙田柚，张家湾大市场；石油醚、NaCl、H2O2溶液、95%乙醇、FeSO4，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；营养琼脂、营养肉汤、DPPH，分析纯，上海蓝季生物试剂有限公司；胰酪大豆胨液体培养基（TSB）、胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA），海博生物科技有限公司；大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，保存于武昌工学院微生物实验室。

为提高xA的估计精度,也可反复将公式(11)得到的估计值作为并再次应用公式(11)获得更精确的xA的估计。

1.2 仪器与设备

ESJ60-4 电子分析天平，上海双旭电子有限公司；GZX-9240MBE 型电热恒温鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；BCD-218A3BR 型冰箱，美菱集团有限公司；RE-2000A 型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；RWS-3 微波多功能实验炉，湖南省中晟热能科技有限公司；FS-1000T 型超声波提取仪，上海生析超声仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 柚皮预处理

CT检查：采用西门子16排CT机，层厚0.625mm，螺距0.516：1，常规扫描，观察腰椎间盘位置及形态，测定腰椎间盘密度；除观察椎小关节、椎体、椎弓情况外，对椎管径线、恻隐窝情况做出评价，进一步确定病变情况。

1.3.2 柚皮精油提取

首先将预处理后的柚皮置于微波中进行加热，冷却后加入沸程为60～90 ℃的石油醚中[16]，置于超声波提取仪内处理400 W、15 min，减压过滤，滤液加入少量氯化钠，取上层清液；最后使用旋转蒸发仪对石油醚及柚皮精油进行分离，得到产物，按照公式（1）计算精油得率[17]。

1.3.3 单因素试验

设置单因素基本实验条件：微波功率450 W、微波时间8 min、超声功率400 W、超声时间15 min、液料比6∶1、萃取温度40 ℃，分别改变微波功率（300、350、400、450、500 W），微波时间（4、6、8、10、12 min），液料比（1∶1、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1），萃取温度（20、30、40、50、60 ℃）等条件，以柚皮精油得率为考察指标，进行单因素试验。

1.3.4 响应面优化试验

在单因素试验的基础上，利用Design expert 13 设计响应面试验，以柚皮精油得率为响应值考察柚皮精油的最佳提取工艺，Box-Behnken 试验设计见表1。

表1 Box-Behnken 试验因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment

1.4 抗氧化及抑菌活性研究

参考Chen 等[18]的方法加以改进，将不同体积的柚皮精油稀释到1%（V/V）的吐温20 溶液中，使用高速乳液均质器充分均质，得到不同体积浓度的精油稀释液，备用。

1.4.1 精油稀释液的制备

1.4.2 抗氧化活性的测定

根据图4 分析，在萃取温度20～40 ℃柚皮精油的得率逐步上升，在40 ℃达到最大值，40 ℃后开始快速下降。低于40 ℃时，温度的升高有利于精油物质的溶出，而高于40 ℃，其他的物质如黄酮类和多酚类等溶解性提高，杂质增多，降低精油的得率。因此，萃取温度应控制在40 ℃左右。

（1）羟自由基清除试验

教师要善于从学生练习的反馈中捕捉到闪光点，及时评价学生练习的结果，充分利用评价语言的魅力，鼓励学生，使学生在品尝到成功喜悦的同时，对学习产生浓厚的兴趣，建立自信。

超微协同提取得到的柚皮精油选择体积分数为2%、4%、6%、8%、10%来测定羟自由基的清除能力，参考Zhao等[19]的测定方法进行测定，以VC 作为对照。

内浮顶储罐主要部件有：浮盘、内浮筒、骨架、梯子、浮顶人孔、周边密封装置、安全通气阀、量油孔、浮盘支腿、浮盘防转装置、导静电线、雷达液位导波管导向装置等组成。浮盘材质主要选用铝及铝合金、不锈钢，浮盘与储罐间加装弹性密封装置来达到对浮盘下油品、油气的密封。浮盘在储罐安全液位范围内上下移动，通过浮盘下安装的浮筒来起伏浮盘运行，同时浮盘上的安全通气阀、支腿在浮盘下落时起到对浮盘的保护和支撑。

（2）DPPH 自由基清除试验

4.4 强化技术指导，引导烟农安全科学合理用药 技术人员要强化技术指导，引导烟农安全科学合理用药。在病虫害暴发初期，及时有效地给烟农指导农药品种选择及施用方法、施用最佳时间，正确的施药部位等。通过多种宣传培训方式，引导烟农转变观念，施药时注意用量，规范施药行为，保护自己及环境安全。在农药品种上尽量使用物理、生物农药进行病虫害的防治，在防治方法上选择绿色防控方式。

1.4.3 抑菌活性的测定

1.认真调查摸清底数。在2016年、2017年调研摸底的基础上，2018年，省局安排部署成立了4个专项督导小组，采取了局站领导全面负责，支部委员、科长分片包干的定点联系责任制，深入全省9个市对26个农场的办社会职能改革情况再次进行调查，认真梳理了各农场办社会职能的项目、资产、债务、机构人员及经费开支等情况，初步明确了农场办社会职能的改革方式，切实做到底数清楚、界限分明、权责清晰、任务明确。

剥离沙田柚果皮表皮，切成1 cm×1 cm×1 cm 的方块[14-15]，取100 g 置于烧杯中，滤纸封口备用。

（1）菌液的制备

参考Friedman 等[21]与Carso 等[22]描述方法并适当修改。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌活化后，分别在平板上划线，挑取单菌落到1 mL TSB 中，37 ℃、200 r/min 摇床过夜培养。稀释涂布，收集106CFU/mL 菌悬液备用。

（2）抑菌活性的测定

参考Kim 等[23]的方法，分别对菌种的抑菌活性进行测定。

(1)大学生对网络借贷平台的认知。在被调查对象中，有64.58%的大学生使用过网络借贷平台。在对网络借贷平台的态度方面，18.75%的大学生认为从网贷平台借贷是一种值得提倡的消费方式，27.08%的大学生则表示反对，54.17%的大学生持中立态度。这表明，大学生对网络借贷平台的认可度适中。在没有使用过网络借贷平台的大学生中，不使用网络借贷平台的主要原因是能够保持收支平衡。这说明，大学生对网络借贷平台的使用与日常收支情况联系紧密。

1.5 数据分析

采用OriginPro 2021 进行图形绘制，SPSS 25 进行单因素方差分析，Design-Except 13 进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 微波功率对柚皮精油得率的影响

由图1 可知，随着微波功率的增加，柚皮精油得率先升高后降低。当微波功率在450 W 时，柚皮精油得率最高，为7.9%。微波功率在200～400 W 时，得率稳步上升；在400～450 W 时，得率迅速上升，可能是由于被加热的水分子冲破了柚皮细胞壁，使细胞内的有效物质得以析出。因此，微波功率选择450 W。

通过实践，发现在语言教学中留白艺术的运用，能有效的促进幼儿的发展。我们将继续研究探索语言教学中留白艺术的运用，并力求做到“留白”不“空白”，让幼儿在语言领域中主动探索、主动交流、主动学习，收到“此处无声胜有声”的艺术效果。

图1 微波功率对柚皮精油得率的影响Fig.1 Effect of microwave power on yield of essential oil from pomelo peel

2.1.2 微波时间对柚皮精油得率的影响

在单因素试验结果的基础上，选取微波功率、微波时间、液料比、萃取温度4 个因素，以柚皮精油的得率为响应值进行Box-Behnken 试验设计，结果见表2。

图2 微波时间对柚皮精油得率的影响Fig.2 Effect of microwave time on yield of essential oil from pomelo peel

2.1.3 液料比对柚皮精油得率的影响

超微协同提取得到的柚皮精油选择体积分数为2%、4%、6%、8%、10%来测定DPPH 自由基的清除能力，参考Dumore 等[20]的测定方法进行测定，以VC 作为对照。

由图3 可知，石油醚并不是越多越好，在1∶1 到6∶1 范围内得率稳步上升；在6∶1 时达到最大值，然后迅速下降。可能是因为萃取试剂与柚皮里有效物质的溶解在6∶1 时达到饱和，再增加石油醚得率不增加，但是在分离时石油醚可以带走更多的柚皮精油，导致在6∶1后的得率降低。因此，选择液料比6∶1 为宜。

图3 液料比对柚皮精油得率的影响Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on yield of essential oil from pomelo peel

2.1.4 萃取温度对柚皮精油得率的影响

4、走农业保险与农业防灾救灾相结合发展之路。农业保险部门要积极与气象、农业等部门沟通，针对各县市区农业生产布局和不同农作物的生长发育阶段，在重大气象灾害前后，派出专家走进田间地头，指导农民进行防灾、减灾和救灾工作，将农业保险向农业防灾、受灾增产等方面延伸，积极为农业经营主体开展防灾减灾服务，通过防灾减灾与保险救济，帮助减少农民灾害损失，促进灾后尽快恢复生产，推进农业保险稳步健康持续发展。

图4 萃取温度对柚皮精油得率的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on yield of essential oil from pomelo peel

2.2 Box-Behnken 试验结果与分析

由图2 可知，微波时间在4～8 min 时，随着微波作用时间的增加，柚皮精油得率也逐步上升，当微波时间大于8 min，柚皮精油得率迅速下降。可能是由于前期为微波作用的升温阶段，在8 min 左右达到最适合的温度，8 min 后则柚皮温度过高，导致柚皮精油汽化。因此微波时间在8 min 左右为宜。

表2 Box-Behnken 试验设计结果Table 2 Results of Box-Behnken test design for proportion optimization

依据表2 中Box-Behnken 的试验结果，使用Design Expert 软件处理得到柚皮精油得率与各个因素之间的多元回归方程：Y=7.97+0.2833A+0.2436B-0.1863C-0.1906D-0.075 0AB+0.025 0AC-0.100 0AD-0.019 2BC+0.125 0BD-0.003 1CD-1.810 0A2-1.250 0B2-0.584 2C2-0.293 8D2。其决定系数R2=0.993 8，表明根据试验结果建立的数学模型对柚皮精油得率的相关度非常高。为了验证方程的可靠性，进一步进行了回归模型方差分析。

徐浡君的风景油画作品以云南石林县圭山、昆明长虫山的石林风景，卡斯特地貌为描绘对象，着力打造这些较为原始的土著风光，其深层目的在于这些未被开发的地区，较少受到所谓现代文明的侵扰，具有一种大朴为美，大美为真的艺术理念。

由表3 分析得到，回归模型F值为136.44、P＜0.000 1、失拟项P＞0.05 不显著、校正决定系数说明数学模型显著，98.79%的柚皮精油的得率可使用该模型分析。A、B、C、D、A2、B2、C2、D2对得率的影响极其显著（P＜0.000 1），BD 对得率的影响显著（P＜0.05）。说明得率与各个因素之间有明显的二次抛物关系，依据各个单因素的F值，可以得到各个因素对柚皮精油得率的影响依次为微波功率＞微波时间＞液料比＞萃取温度。

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

微波功率（A）、微波时间（B）、液料比（C）、萃取温度（D）对精油得率两两交互影响如图5，图中AB、AC、BD曲面较为陡峭，但AB、AC 曲面图中等高线图椭圆不如BD 明显，故BD 交互显著性明显。通过多元回归方程计算，得到最佳柚皮精油提取工艺为微波功率450 W、微波时间8 min、液料比6∶1（mL/g）、萃取温度36.8 ℃。在此工艺条件下经过5 次验证得到得率为（8.0±0.33）%，与预测值8.034%极接近，表明响应面模型模拟结论具有可行性，与实际情况极为接近。

但10月原油创出阶段新高后拐头直下，不到4个月时间又暴跌了40%，而此次市场形成共识的驱动因素有四个，一是沙特、俄罗斯产量持续创新高，市场担忧OPEC减产协议实际效果削弱，二是美国原油产量持续增加，加重全球供过于求局面，三是美国经济增长周期见顶以及川普发动的贸易保护可能令全球经济放缓，未来几年原油需求放缓。四是美联储处于加息周期中，原油属于风险资产，资金有出清避险需求。

图5 交互影响得率的响应面图Fig.5 Response surface diagram of interaction of factors affecting yield

2.3 柚皮精油的抗氧化性

2.3.1 柚皮精油对羟自由基的清除率

由图6 可知，柚皮精油与VC 随着浓度的增加对羟自由基清除率均有增加，其中柚皮精油对羟自由基清除率上升最为明显；在体积分数为10%时两者无明显差异，对羟自由基清除率均达到95%以上，其中精油清除率为98.29%。因此柚皮精油体积分数为10%时，对羟自由基的清除率效果显著。

图6 柚皮精油对羟自由基清除率Fig.6 Hydroxyl radical scavenging rates of essential oil from pomelo peel

2.3.2 柚皮精油对DPPH 自由基的清除率

由图7 可知，两者对DPPH 自由基清除率的曲线几近平行上升，在最大试验浓度10%时，VC 的清除率接近70%，柚皮精油的清除率为49.28%，说明柚皮精油还原性较VC 弱，依据曲线趋势需继续增加浓度。

图7 柚皮精油对DPPH 的清除率Fig.7 DPPH scavenging rates of essential oil from pomelo peel

2.4 柚皮精油的抑菌活性

由表4 可知，用1%（V/V）的吐温20 溶液作为对照组，随着精油浓度的增加，抑菌效果不断增强，在试验最大浓度10%（V/V）时，精油对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌作用最强，金黄色葡萄球菌此时的浓度为（5.92±0.11）log CFU/mL、大肠杆菌浓度为（6.08±0.09）log CFU/mL，分别比空白低3.13log CFU/mL 和2.90log CFU/mL。结果表明，柚皮精油对金黄色葡萄球菌的抑制效果优于大肠杆菌，这与柑橘精油的文献结果一致[24-25]，说明精油及其化合物对革兰氏阳性菌的抑制作用强于革兰氏阴性菌的抑制作用。

表4 不同浓度柚皮精油对革兰氏菌的抑菌效果Table 4 Antibacterial effect of essential oils from pomelo peel with different concentrations on gram-positive bacteria

3 结论

本试验以柚皮为原料，采用微波超声协同的提取方法，利用单因素联合响应面对提取工艺进行了优化，得到柚皮精油提取的最佳工艺参数为微波处理功率450 W、微波处理时间8 min、超声功率400 W、超声时间15 min、石油醚与柚皮的比例6∶1（mL/g）、萃取温度36.8 ℃，此条件得率为（8.0±0.33）%，制得的精油为澄清的金黄色透明液体，具有柚子清香。

在混凝土制备过程中，最为关键的问题是配合比的确定。目前大多数的工程项目使用预拌混凝土，在混凝土制备过程中，由混凝土搅拌站的试验室来提供准确的配比。而对一些需要现场搅拌混凝土的工程项目，混凝土原材料配比的确定相对困难一些，要充分考虑水泥特性、砂石级配、含水率等因素。只有选择合理的配比，才能保证混凝土的强度以及工作性。

精油体积分数为10%时，对羟自由基清除率达到了98.29%，DPPH 自由基的清除率则为49.28%。在精油体积分数为10%时，金黄色葡萄球菌比空白低3.13log CFU/mL、大肠杆菌比空白低2.90log CFU/mL。此方法提取的柚皮精油有较优秀的抑菌活性和一定的抗氧化活性，可应用于食品保鲜。