川崎病患儿外周血LncRNA SNHG5 miR-132 的差异表达及临床意义

沈 韬 张海涛 顾旭华 金 律

川崎病（Kawasaki disease，KD）是一种好发于5 岁以下婴幼儿及儿童的自身免疫性疾病，以全身性中小血管炎为主要病理特征［1］。冠状动脉是KD 最常见的受累血管，KD 导致的冠状动脉病变（coronary artery lesion，CAL）是患儿死亡的首要原因，也是目前儿童后天性心脏病的主要病因［2-3］。在临床实践中，KD 的早诊断、早治疗对减少CAL 的发生具有重要意义，但目前KD 的诊断主要依靠临床症状，缺乏特异性实验室指标。因此，寻找KD 特异性的诊断标志物是KD 相关研究的热点之一。

长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）和微小RNA（microRNA，miR）是在体内发挥复杂生物学作用的非编码RNA，lncRNA 能够吸附miR 并抑制miR 对下游靶基因的调控作用，lncRNA 靶向miR 不仅是多种疾病发病机制的研究靶点，异常表达的lncRNA及miR 也能释放进入血液循环并成为诊断疾病、评估病情的标志物。一项KD 相关的临床研究通过基因芯片技术证实，KD 患儿外周血中存在LncRNA LINC00999-miR-6780 轴、LncRNA PSORS1C3-miR-216a 轴、LncRNA SNHG5-miR-132/miR-92 轴表达的变化［4］。目前，lncRNAs 及miRs 用于KD 诊断及病情评估尚缺乏足够的临床研究证据。因此，本研究将通过荧光定量PCR 的技术对KD 患儿外周血中上述几种lncRNAs 及miRs 表达的变化进行验证，旨在筛选能够用于KD 诊断及病情评估的标志物，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2016 年1 月至2020 年12 月在苏州市中西医结合医院儿科确诊的62 例KD 患儿作为研究的KD 组，纳入标准：①结合病史、症状体征、辅助检查，符合诊断与治疗专家共识［5］中KD 的诊断标准；②未接受过KD 的治疗；③按lncRNAs、miRs 表达的检测，在入组后当天或次日要求留取空腹外周静脉血；④临床资料完整；⑤入组后当天或次日进行心超检查。排除标准：①合并现症感染的患儿；②伴有其他心血管系统疾病；③合并先天性畸形、遗传代谢病；④接受过丙种球蛋白、阿司匹林等治疗。另取同期在我院进行健康体检的80 例健康儿童作为对照组。KD 组中男性39 例、女性23 例，年龄10 个月～7 岁、平均（3.31±0.62）岁；出生周龄36～41 周，平均（38.92±7.39）周；对照组中男性48 例、女性32 例，年龄1～8 岁、平均（3.52±0.77）岁，出生周龄36～41 周，平均（38.44±7.62）周。两组对象一般资料的比较，差异无统计学意义（P>0.05）。本研究获得医院伦理委员会批准后实施（伦理号：2016 伦审批第002 号）。

1.2 外周血lncRNAs、miRs 表达水平的检测 KD 组患儿入组后晨起空腹时采集外周静脉血5 mL，对照组儿童体检时采集空腹外周静脉血5 mL，采用血液RNA提取试剂盒（货号：19241ES50，上海翌圣生物科技公司）提取外周静脉血的总RNA，采用lncRNA cDNA 第一链合成试剂盒（货号：KR202，北京天根生化科技公司）对RNA 进行反转录得到lncRNA cDNA，miR cDNA第一链合成试剂盒（货号：KR201，北京天根生化科技公司）对RNA 进行反转录得到miR cDNA，cDNA 放置在-20℃保存。

取cDNA 进行荧光定量PCR 检测。采用lncRNA荧光定量检测试剂盒（货号：FP402，北京天根生化科技公司）对lncRNA 进行检测，采用miR 荧光定量检测试剂盒（货号：FP401，北京天根生化科技公司），反应体系：cDNA 10 ng、预混液 10 μL、10 μmol/L 的正向引物（序列5’-TATCGTATGCTAGCTAGCT-3’）和反向引物（5’-TATGCGTAGGTAGCTAGCT-3’）各0.5 μL、去离子水补足至20 μL；反应程序：95℃预变性15 min，94℃20 s、60℃ 34 s、重复40 个循环，得到反应的循环曲线及循环阈值（Ct），以U6 为内参、按照公式2-△△Ct计算LncRNA LINC00999、miR-6780、LncRNA PSORS1C3、miR-216a、LncRNA SNHG5、miR-132、miR-92 的表达水平。

1.3 实验室指标的检测 KD 组患儿入组后晨起空腹时采集外周静脉血，对照组儿童体检时采集空腹外周静脉血，采用血常规仪检测白细胞计数（white blood cell，WBC）、血红蛋白（hemoglobin，HB）、血小板计数（platelet，PLT），采用红细胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）测定仪检测ESR，采用全自动生化分析仪检测丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、肌酐（creatinine，Cr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、C 反应蛋白（C-reactive protein ，CRP）。

1.4 CAL 的评估 参照《川崎病冠状动脉病变的临床处理建议》［6］，采用彩色多普勒超声诊断仪对KD 患儿进行超声心动图检查，对左冠状动脉主干、左前降支、左回旋支、右冠状动脉及后降支冠状动脉进行扫查，出现冠状动脉扩张、狭窄或冠状动脉瘤等超声表现判断为CAL。根据评估结果将KD 患儿分为CAL 组和无CAL（non-CAL，NCAL）组。

1.5 统计学方法 采用SPSS21.0 软件录入数据，计量资料以表示，两组间比较采用独立样本t检验，相关性分析采用Pearson 检验。分别以《儿童风湿性疾病相关巨噬细胞活化综合征诊断与治疗专家共识之五--川崎病篇》中KD 的诊断标准和《川崎病冠状动脉病变的临床处理建议》中KD 合并CAL 的诊断标准为金标准，采用Prism 软件通过绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线对LncRNA SNHG5、miR-132 诊断KD 及KD 合并CAL 的效能进行探讨。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组对象外周血lncRNAs 及miRs 表达水平的比较 KD 组外周血中LncRNA SNHG5 的表达水平高于对照组，miR-132 的表达水平低于对照组（均P<0.05）；两组外周血中LncRNA LINC00999、LncRNA PSORS1C3、miR-6780、miR-216a、miR-92 的表达水平比较均无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1 KD组与对照组外周血lncRNAs及miRs表达水平的比较

2.2 KD 组中LncRNA SNHG5、miR-132表达水平的相关性 KD 组患儿外周血中LncRNA SNHG5 的表达水平与miR-132 的表达水平呈负相关（r=-0.527，P<0.001）。

2.3 LncRNA SNHG5、miR-132表达水平对KD 的诊断价值 以专家共识中KD 的诊断标准作为金标准，分析外周血LncRNA SNHG5、miR-132 表达水平对KD 的诊断价值。在Prism 软件中录入数据并进行定义，1 定义为符合KD 诊断、0 定义为健康儿童，得到ROC 曲线见图2，两项指标均对KD 具有诊断价值，见表2。

图1 KD 组中LncRNA SNHG5、miR-132 表达水平相关性的散点图

表2 外周血LncRNA SNHG5、miR-132表达水平诊断KD的效能

2.4 KD 组中LncRNA SNHG5、miR-132表达水平与实验室指标的相关性 KD 组中LncRNA SNHG5 的表达水平与CRP、ESR 呈正相关，miR-132 的表达水平与CRP、ESR 呈负相关（P<0.05）；LncRNA SNHG5、miR-132 表达水平与WBC、HB、PLT、ALT、AST、TC、TG、Cr、BUN 无相关性（P>0.05）。见表3。

表3 KD组中LncRNA SNHG5、miR-132表达水平与实验室指标的相关性

2.5 KD 组中CAL 与NCAL 患儿LncRNA SNHG5、miR-132 表达水平的比较 KD 组CAL 患儿外周血中LncRNA SNHG5 的表达水平高于NCAL 患儿，miR-132的表达水平低于NCAL 患儿，差异有统计学意义（P<0.05）。见表4。

表4 KD组中CAL与NCAL患儿LncRNA SNHG5、miR-132表达水平的比较

2.6 LncRNA SNHG5、miR-132 表达水平对KD 患儿CAL 的诊断价值 参照《川崎病冠状动脉病变的临床处理建议》［6］中CAL 的标准作为金标准，分析外周血LncRNA SNHG5、miR-132 表达水平对KD 患儿CAL的诊断价值。在Prism 软件中录入数据并进行定义，1定义为符合CAL 诊断、0 定义为不符合CAL 诊断，得到ROC 曲线见图3，两项指标均对KD 患儿CAL 具有诊断价值，诊断效能见表5。

图3 外周血LncRNA SNHG5、miR-132表达水平诊断KD患儿CAL的ROC曲线

表5 外周血LncRNA SNHG5、miR-132表达水平诊断KD患儿CAL的效能

3 讨论

KD 是一类急性发热性出疹性疾病，以全身免疫系统活化及血管内皮系统损害为特征，可累及动静脉及毛细血管并造成心血管系统并发症［7-8］。KD 的发病机制至今仍不十分明确，虽然在急性期会出现WBC、CRP、ESR 等指标升高，但上述指标用于KD 诊断的缺乏特异性，目前临床上诊断KD 仍主要依靠临床表现，不典型病例容易出现误诊漏诊。因此，寻找KD 诊断标志物具有迫切的临床需求。

LncRNAs 及miRs 是参与基因表达转录后调控的非编码RNA，LncRNAs 能够通过类似“分子海绵”的作用吸附miRs、抑制miRs 对下游靶基因的负性调控作用，最终形成lncRNA-miR-靶基因轴并在不同疾病的病理生理过程中发挥生物学作用。同时，在疾病发病过程中异常表达的lncRNAs 及miRs 会造成外周循环中相应分子表达的变化，进而可以作用诊断疾病及评估病情的标志物［9-12］。本研究在Guo 等的研究基础上对KD 患儿外周血中LncRNA LINC00999-miR-6780轴 、LncRNA PSORS1C3-miR-216a 轴 、LncRNA SNHG5-miR-132/miR-92 轴的表达进行了荧光定量PCR 的验证，lncRNAs 及miRs 表达变化的趋势与微阵列数据库分析的结果吻合，但只有LncRNA SNHG5 及miR-132 表达水平在KD 患儿与健康儿童的比较中有统计学差异，因此本文将继续探索LncRNA SNHG5 及miR-132 在KD 发病中的作用。

已有国内外相关的临床研究使用外周血LncRNA SNHG5 及miR-132 疾病的诊断，包括LncRNA SNHG5用于胃癌［13］、非小细胞肺癌［14］的诊断及miR-132 用于脓毒症心肌病［15］、动脉粥样硬化［16］、非酒精性脂肪肝［17］的诊断。基于KD 患儿外周血中LncRNA SNHG5 及miR-132 表达的微阵列检测结果及荧光定量PCR 检测结果，本研究将上述两种分子用于KD 的诊断，经ROC曲线分析证实外周血LncRNA SNHG5 及miR-132 均对KD 具有诊断价值，且诊断效能理想、LncRNA SNHG5 诊断的灵敏性和特异性均超过85%，通过扩大研究的样本量可能有助于找到LncRNA SNHG5 诊断KD 更理想的截断值，进而提高诊断的灵敏度和特异性。

LncRNA SNHG5 对miR-132 具有靶向调控作用，相关研究分别在慢性阻塞性肺疾病、结直肠癌、宫颈癌模型中证实，LncRNA SNHG5 与miR-132 具有靶向调控关系［18-20］。本研究在KD 患儿中通过相关性分析证实：LncRNA SNHG5 与miR-132 的表达具有负相关关系，提示在KD 的发病过程中LncRNA SNHG5 可能靶向miR-132 并发挥作用。目前关于miR-132 生物学作用的研究认为靶向PTEN、NF-κB、p38/JNK 等促炎、促凋亡基因是其主要的生物学效应，高表达的miR-132 能够通过抗炎、抗凋亡作用减轻不同病理因素引起的内皮细胞损伤［18，21-23］。广泛的血管内皮系统损害是KD 的重要特征，本研究已经发现KD 患儿外周血中LncRNA SNHG5 表达增加及miR-132 表达降低且具有负相关的结果提示高表达的LncRNA SNHG5 可能通过抑制miR-132、削弱其抗炎及抗凋亡作用，进而造成KD 的发病。基于此推测，本研究收集了KD 患儿的实验室指标并进行相关性分析，结果显示：LncRNA SNHG5 与CRP、ESR 呈正相关，miR-132 与CRP、ESR呈负相关。CRP 和ESR 是评价KD 病情的非特异性指标，水平升高反映了病情活动及炎症激活，上述相关性分析的结果提示LncRNA SNHG5 及miR-132 表达的变化与KD 病情的进展相关。

全身性中小血管炎是KD 主要的病理特征，其中CAL 是KD 最常见的血管并发症，也是影响预后、增加心血管疾病发生风险的主要原因。在KD 的早诊断、早治疗中，准确评估CAL 是重要一环。超声心动图是目前评估KD 患儿的CAL 的主要辅助检查手段［24-25］，但因为患儿年龄较小、对检查的配合度较低，部分患儿需要使用基础麻醉才能完成检查，使得该项检查在KD 患儿中的应用受到限制。本研究使用LncRNA SNHG5 及miR-132 作为标志物进行KD 患儿CAL 的诊断，与NCAL 的KD 患儿比较，合并CAL 的KD 患儿外周血LncRNA SNHG5 表达水平增加、miR-132 表达水平降低，且两项标志物均对KD 患儿的CAL 具有诊断价值，虽然诊断的灵敏性和特异性均不足80%，但仍然可以为今后使用LncRNA SNHG5、miR-132 两项标志物进行KD 合并CAL 的诊断提供依据。

综上所述，在KD 的发病过程中存在多种lncRNAs及miRs 表达的变化，其中LncRNA SNHG5 表达水平显著增加、miR-132 表达水平显著降低且具有负相关关系；LncRNA SNHG5 和miR-132 不仅对KD 具有诊断价值，还对KD 合并CAL 具有诊断价值，是未来用于诊断KD 及KD 合并CAL 的潜在标志物。同时，KD 患儿LncRNA SNHG5 及miR-132 的表达水平还与CRP、ESR 存在相关性，提示LncRNA SNHG5/miR-132 轴的变化与KD 病情活动及炎症激活有关，这也为今后研究KD 的发病机制提供了新思路。