CGF在炎症微环境下对人牙周膜细胞成骨抑制作用的影响

廖阳阳 李思贝 张彩美 谢成婕

【摘 要】目的 研究濃缩生长因子（CGF）在炎症微环境下对人牙周膜细胞（hPDLCs）成骨抑制作用的影响。方法 分离、培养并鉴定hPDLCs，并采用脂多糖（LPS）制造细胞炎症微环境，分别将全血（对照组）、Con组、LPS组和CGF组与hPDLCs共培养，使用1%、5%、10%的LPS、CGF分别对hPDLCs处理24、48、72 h，进行成骨诱导，观察不同TGFβ1和IGF-1浓度下各组CGF中含有存在成骨相关生长因子水平、炎症微环境下hPDLCs的各组ALP活性、qPCR检测各组成骨相关生长因表达量。结果 CGF+DMEM培养基中TGFβ1、IGF-1浓度均显著高于DMEM培养基、CGF析出液（P<0.01）；hPDLCs细胞较为均一，无明显杂质细胞，形态稳定，生长旺盛，进一步对hPDLCs进行LPS及CGF干预后，与Con组比较，ALP在LPS组明显下降，而经过CGF干预后ALP的浓度有所回升，甚至比Con组更高；CGF组干预后ALP活性显著高于对照组、LPS组，且LPS组低于对照组、炎症组（P<0.01）；炎症微环境下，CGF组hPDLCs成骨标志物ALP、COL1及OCN的表达量显著高于Con组、LPS组（P<0.01）。结论 CGF在炎症微环境下对改善人牙周膜细胞成骨抑制作用具有积极的影响，可提高成骨相关因子（ALP、COL1、OCN）水平，促进成骨分化的相关转录因子表达量，从而有效修复人牙周膜细胞在炎症微环境下的成骨抑制作用。

【关键词】CGF；炎症微环境；人牙周膜细胞；成骨抑制

中图分类号：R781 文献标识码：A 文章编号：1004-4949（2023）18-0065-05

基金项目：广东省医学科学技术研究基金-面上项目（编号：B2022024）

Effect of CGF on Osteogenic Inhibition of Human Periodontal Ligament Cells in Inflammatory Microenvironment

LIAO Yang-yang1， LI Si-bei2， ZHANG Cai-mei3， XIE Cheng-jie1

（1.Department of Periodontal Disease， Haizhu Square Campus， Stomatological Hospital， Southern Medical University， Guangzhou 510280， Guangdong， China； 2.The Third Department of Surgery， Guangzhou Chest Hospital，Guangzhou 510095， Guangdong， China； 3.Department of Dentistry and Endodontics， Haizhu Square Campus， Stomatological Hospital， Southern Medical University， Guangzhou 510280， Guangdong， China）

【Abstract】Objective To investigate the effect of concentrated growth factor （CGF） on the osteogenic inhibition of human periodontal ligament cells （hPDLCs） in an inflammatory microenvironment. Methods hPDLCs were isolated， cultured and identified， and lipopolysaccharide （LPS） was used to create an inflammatory microenvironment. Whole blood （control group）， Con group， LPS group and CGF group were co-cultured with hPDLCs， and hPDLCs were treated with 1%， 5%， and 10% LPS and CGF for 24， 48， and 72 h， respectively. Osteogenic induction was performed to observe the levels of osteogenic-related growth factors in CGF of each group at different concentrations of TGFβ1 and IGF-1， the ALP activity of hPDLCs in each group under the inflammatory microenvironment， and the expression of bone-related growth factors in each group by qPCR. Results The concentrations of TGFβ1 and IGF-1 in CGF+DMEM medium were significantly higher than those in DMEM medium and CGF precipitation solution （P<0.01）. The hPDLCs cells were relatively uniform， with no obvious impurity cells， stable morphology and vigorous growth. After further LPS and CGF intervention on hPDLCs， compared with the Con group， ALP decreased significantly in the LPS group， while the concentration of ALP increased after CGF intervention， even higher than the Con group； the ALP activity of the CGF group was significantly higher than that of the control group and the LPS group， and that in the LPS group was lower than that in the control group and the inflammation group （P<0.01）. Under the inflammatory microenvironment， the expression levels of osteogenic markers ALP， COL1 and OCN in hPDLCs of CGF group were significantly higher than those of Con group and LPS group （P<0.01）. Conclusion CGF has a positive effect on improving the osteogenic inhibition of human periodontal ligament cells in the inflammatory microenvironment. Meanwhile， it can increase the levels of osteogenic related factors （ALP， COL1， OCN） and promote the expression of transcription factors related to osteogenic differentiation， so as to effectively repair the osteogenic inhibition of human periodontal ligament cells in the inflammatory microenvironment.

【Key words】CGF； Inflammatory micro-environment； Human periodontal ligament cells； Osteogenesis inhibition

牙周炎（periodontitis）是影响牙齿支持组织的慢性感染性疾病，可引起牙周附着丧失、牙龈退缩，严重者可导致牙齿松动、脱落[1]。重度牙周炎患者往往伴有牙周骨内缺损病变，是牙周疾病治疗的重点和难点。牙周治疗的最终目标是修复和重建已破坏的牙周组织，实现牙周组织再生。不同的骨移植材料被应用于临床研究中，包括牙周引导组织再生术、牙周骨移植术等。不同疗法的治疗效果存在一定差异，且目前多种治疗方法均无法使缺损的牙周支持组织得到真正意义上的再生，治疗目标在于恢复牙周组织生理结构和功能[2]。研究显示[3，4]，人牙周膜细胞（human periodontal ligament cells，hPDLCs）作为牙周组织的主要功能成分，在一定条件下具有向成牙骨质细胞、成骨细胞等方向分化的潜能，其潜在的成骨分化能力，为临床治疗牙周骨缺损提供了新的方向。但是牙周炎的炎症环境对hPDLCs成骨分化具有一定影响，可能会抑制牙周膜细胞成骨作用。而浓缩生长因子（concentrated growth factors，CGF）作为新一代血小板制品，其主要成分包括各种生长因子，可调控细胞的聚集、增殖和分化过程，促进牙周组织再生和修复的进程[5]。基于此，在牙周炎炎性环境中，CGF可能一定程度促进hPDLCs增殖和成骨分化，但是具体的作用机制尚未完全明确。本研究通过建立实验模型进一步探究CGF在炎症微环境下对人牙周膜细胞成骨抑制作用的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料和设备 DMEM高糖培养基、胎牛血清（Gibco公司，美国），TGFβ1-ELISA Kit（Boster，中国武汉），一次性真空采血管、细胞培养皿（Corning公司，美国），CGF离心机（Medifuge公司，意大利），大肠杆菌脂多糖LPS（SIGMA公司，美国），BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒（碧云天生物技术有限公司，中国上海），碱性磷酸酶检测试剂盒（碧云天生物技术有限公司，中国上海），总RNA提取试剂盒（Takara，日本），反转录试剂盒 （Thermo公司，美国），qPCR反应体系：Maxima TM SYBR Green/ROX qPCR Master Mix （2X）（Thermo Fisher Scientific，美国）。

1.2 hPDLCs的传代与培养 收集18～25岁志愿者拔除的健康正畸前磨牙，反复冲洗后刮取牙根中1/3部位的牙周膜组织，采用组织块法进行原代培养，直至细胞从组织块周围爬出并长满约培养皿底80%左右区域。利用0.25%胰酶消化，传代，将此代细胞记为第1代细胞（P1）[6]。P1代细胞长满皿底约90%左右，再次使用0.25%胰酶消化、传代，方法同前，使用2-4代细胞进行实验。本实验由南方医科大学口腔医院伦理委员会批准（批准号：2021-23），所有志愿者均已签署知情同意书。

1.3 血小板浓缩制品的制备与血小板计数

1.3.1 CGF制备 各抽取10名18～25岁健康志愿者肘静脉全血5 ml（不加入抗凝剂）。按照Medifuge公司离心机CGF制备程序离心，分为3层：上层为贫血小板血浆层，下层为红细胞层，中间即为CGF凝胶层（挤压CGF凝胶得到CGF析出液，CGF liquid）。取CGF層置于含有5 ml DMEM培养基内，静置5 min，然后放置在37 ℃，5% CO2培养箱中，7 d后取出CGF浸出液，离心，过滤，-80 ℃保存，为CGF+DMEM培养基，用于细胞实验。

1.3.2脂多糖（LPS）炎症微环境制备 将第2-4代hPDLCs以每孔1×105个细胞的密度铺于6孔板。在细胞生长至50%融合时进行分组：①Con组：hPDLCs+DMEM；②LPS组：hPDLCs+ 10 μg/ml LPS+DMEM；③CGF组：hPDLCs+ 10 μg/ml LPS+10%CGF+DMEM。

1.4 检测PRP、CGF对hPDLCs增殖能力的影响

1.4.1ELISA 采用酶标仪分别对TGFβ1及IGF-1浓度进行检测。按照酶联免疫吸附测定试剂盒说明，分别设空白孔、标准孔、待测样品孔，其中空白孔加标准品和样品稀释液100 μl，余孔分别加标准品或待测样品100 μl。为保证实验结果有效性，每次实验均使用新的标准品溶液。按照酶标测试程序反应后，最终用酶标仪在450 nm 波长处测量各孔待测液的OD值[7]。

1.4.2碱性磷酸酶（ALP）染色 选取生长良好的第2-4代hPDLCs以相同数量、相同条件接种于6孔板，待细胞生长约50%时换为成骨矿化诱导液，按照分组分别培养7 d后，4%多聚甲醛固定3 min，PBS洗涤2～3次，每孔加入1 ml BCIP/NBT工作液，室温避光放置15 min，PBS洗涤2～3次，观察ALP染色情况。

1.4.3 ALP活性检测 选取生长良好的第2-4代hPDLCs以相同数量、相同条件接种于6孔板，待细胞生长约50%时换为成骨矿化诱导液，按照分组分别培养7 d后，PBS清洗3次，配置ALP活性测定工作液，添加工作液至96孔板，37 ℃环境中孵育30 min，加入显色液。酶联免疫检测仪在405 nm波长条件下检测，记录数据。

1.4.4 qPCR检测成骨相关基因mRNA表达 选取生长良好的第2-4代hPDLCs细胞，分别标记为上述分组。采用Trizol总RNA法提取各组细胞RNA，参照试剂盒说明书合成cDNA模板，用获得的cDNA进行qPCR[8]。检测成骨相关基因：ALP，Ⅰ型胶原蛋白（Collagen-Ⅰ，COL1）和骨钙素（OCN）。以GAPDH作为组内对照，对各组成骨基因表达量进行相对定量分析，见表1。

1.5 统计学方法 采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析，计数资料以[n（%）]表示，行χ2检验；计量资料以（x-±s）表示，行t检验；P<0.05表示差异有统计学意义，P<0.01表示统计学意义显著。

2 结果

2.1 CGF中含有存在成骨相关生长因子 CGF+DMEM培养基中TGFβ1、IGF-1浓度均显著高于DMEM培养基、CGF析出液（P<0.01），见图1。

2.2 CGF对炎症微环境下hPDLCs成骨抑制的修复 hPDLCs 细胞较为均一，无明显杂质细胞，形态稳定，生长旺盛（见图2A、图2B）。进一步对hPDLCs进行LPS及CGF干预后，与Con组比较，ALP在LPS组明显下降，而经过C G F干预后A L P的浓度有所回升，甚至比Con组更高（见图2C～图2H）。CGF组干预后A L P活性显著高于对照组、L P S组，且LPS组低于对照组、炎症组（P<0.01），见图2I。

2.3 炎癥微环境下CGF对成骨的抑制 炎症微环境下，CGF组hPDLCs成骨标志物ALP、COL1及OCN的表达量显著高于Con组、LPS组（P<0.01），见图3。

3 讨论

牙周炎患者的牙周局部微环境是高浓度炎症微环境，会抑制牙周膜细胞的成骨分化，导致牙槽骨缺失，最终导致牙齿脱落[9]。CGF作为血小板浓缩制品，在血小板被激活后，可释放多种生物活性物质，包括多种生长因子，如血小板源性生长因子（PDGF）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、血管内皮生长因子（VEGF）等，可促进成纤维细胞和成骨细胞的增殖和分化、血管生成，从而加速伤口愈合[10]。PRP具有促进骨重建、减轻术后反应、抗感染及炎症调节等作用[11]。CGF作为第3代血小板浓缩制品，也具有促进细胞增殖、成骨分化和促进血管生成等作用[12]。从理论基础上分析，CGF在炎症微环境下对人牙周膜细胞成骨抑制作用具有一定的修复作用，但是具体的作用还需要进一步探究。

本研究结果显示，采用使用10μg/ml LPS模拟牙周炎患者的高浓度炎症微环境，发现其对牙周膜细胞（PDLCs）的成骨能力有显著抑制作用。原因在于牙周炎的炎症环境中含有TNF-ɑ、IL-1、IL-6等炎症因子，炎症微环境会抑制PDLCs的成骨分化能力，并受到多种通路调控。同时，CGF+DMEM培养基中TGFβ1、IGF-1浓度均显著高于DMEM培养基、CGF析出液（P<0.01），提示CGF干预可促进TGFβ1、IGF-1浓度升高。由于CGF含有TGFβ、IGF-1等成分，是促进成骨所需物质，并且TGFβ/Smad通路是经典的成骨通路。TGFβ1是TGFβ超家族成员之一，TGFβ超家族包括TGFβ蛋白、活化素、蛋白及其他相关蛋白，TGFβ蛋白结合受体（TGFβRⅠ和TGFβRⅡ）后通过smad蛋白转导信号至目标基因，促进细胞成骨分化。而TGFβ1作为TGFβ/ smad信号通路的启动者，同时可诱导骨髓间充质干细胞成骨分化。而在PDLCs中TGFβ1同样有成骨诱导能力。因此，TGFβ1在CGF对PDLCs诱导成骨中起着重要作用。CGF组干预后ALP活性显著高于对照组、LPS组，且LPS组低于对照组、炎症组（P<0.01），表明在炎症环境下，PDLCs内成骨相关基因的表达降低，从而导致其成骨能力减弱，CGF内所含的促成骨相关生长因子将发挥重要作用。因此，通过加入CGF，PDLCs炎症状态下的骨生成抑制作用被修复，甚至较对照组有所增加，说明CGF具备挽救PDLCs因炎症环境所致的成骨抑制。该结论与张志媛等[13]研究结果基本一致。此外，炎症微环境下，CGF组hPDLCs成骨标志物ALP，COL1及OCN的表达量显著高于Con组、LPS组（P<0.01），提示炎症微环境下，CGF的加入可使hPDLCs的成骨标志物ALP，COL1及OCN表达水平提高，从而促进骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化。因此，CGF可影响成骨相关基因表达，与细胞成骨分化关系密切。可见，CGF具有的成骨修复能力是其挽救PDLCs炎症环境下成骨的重要基础。

综上所述，炎症微环境下CGF可以促进hPDLCs增殖，增强ALP，COL1及OCN的表达，达到修复hPDLCs成骨抑制的作用。CGF有望在牙周组织重建中发挥重要作用，但其作用机制还需要进一步的临床研究探究。CGF炎症状态下的成骨机制将是下一步研究的重点。

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编辑 扶田