正相色谱法测定盐酸伊伐布雷定中对映异构体

沈阳，马婷伟，吴晶，柴雨柱

（南京正大天晴制药有限公司，江苏 南京 210046）

盐酸伊伐布雷定（Ivabradine Hydrochloride）是首个单纯减慢心率的特异性If抑制剂，本品适用于窦性心律且心率≥75 次/分钟、伴有心脏收缩功能障碍的NYHAII-IV级慢性心力衰竭患者，与标准治疗β-受体阻碍滞剂联合用药，或者用于禁忌或不能耐受β-受体阻碍滞剂治疗时。其作用机制是通过选择性抑制心脏起搏点If（控制在窦房结内的自发舒张去极化和调节心率）电流，对窦房结有选择性作用而对心脏内传导、心肌收缩或心室复极化无作用[1-3]。本品的特异性决定了其对支气管、血脂、血糖、血压无干扰的特点，在减慢心率的同时不影响心肌收缩和平均射血室壁压；治疗剂量下不影响QTc，无尖端扭转风险，也不干扰心房、房室结、希氏-浦肯野系统及心室的传导功能[4-5]。

盐酸伊伐布雷定由法国施维雅（Servier）公司研发，于2005年10月欧洲药品审评署（EMEA）批准在27个欧洲国家上市，商品名为Procoralan。2014年4月，FDA授予Amgen 公司实验性药物伊伐布雷定治疗慢性心脏衰竭（HF）的快速通道地位。

盐酸伊伐布雷定具有一个手性中心，为S 异构体，分子结构图见图1。R 型异构体暂无药理活性，其含量需要严格控制，以保证产品的质量安全[6]。目前，盐酸伊伐布雷定异构体的检测标准暂未收载在各国药典中，国内也没有局颁标准，相关文献鲜有报道[7-11]。我们参考了文献和各技术研究指导原则，结合该产品的生产工艺，建立了盐酸伊伐布雷定原料药中R-异构体测定的方法——正相色谱法，以期为该原料药质量控制提供依据。

图1 盐酸伊伐布雷定分子结构图

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20AT液相色谱仪，Lasolution色谱工作站，日本岛津公司；XP205DR 电子分析天平，METTLER TOLEDO 公司。

1.2 试药

供试品，盐酸伊伐布雷定，南京正大天晴制药有限公司，批号：121001；对照品，盐酸伊伐布雷定工作对照品，南京正大天晴制药有限公司，批号：20120720；对映异构体，南京正大天晴制药有限公司，批号：20120725；正己烷、异丙醇、三乙胺、乙醇、二乙胺、三氟乙酸均为色谱级。

2 检测方法的选择

2.1 波长的筛选

分别取盐酸伊伐布雷定、对映异构体对照品适量，先加入乙醇溶解（每10 mL 量瓶中加入2 mL），再用正己烷∶乙醇∶二乙胺∶三氟乙酸（92∶8∶0.1∶0.1）稀释制成每1 mL 中约含25 μg 的溶液，作为供试品溶液。在190～400 nm范围内进行紫外扫描，结果见图2。

图2 盐酸伊伐布雷定与对映异构体的紫外扫描（nm）

结果与分析：盐酸伊伐布雷定与对映异构体均在286 nm 和210 nm 波长附近有最大吸收，在对映异构体测定波长选择时，我们综合考虑，选择干扰较小的286 nm作为本品对映异构体的测定波长。

2.2 色谱条件的筛选

参考盐酸伊伐布雷定原临床申报标准（南京正大天晴制药有限公司），优化对映异构体测定色谱条件。当选用CHIRALPAK AS-H（4.6×250 mm，5 μm）色谱柱，流动相条件设定为正己烷∶乙醇∶二乙胺∶三氟乙酸（92∶8∶0.1∶0.1），流速为0.5 mL·min-1时，盐酸伊伐布雷定（主峰）与对映异构体（杂质）保留时间（RT）分别为123.373 min、137.356 min，目标峰保留时间较晚，检测效率低；当流速改为0.8 mL·min-1时，相同条件下盐酸伊伐布雷定与对映异构体的RT 分别为79.073 min、88.828 min，峰型较宽，分离度为1.469，无法达到基线分离。

选用CHIRALPAK AD-H（4.6×250 mm，5 μm）色谱柱，流速设为0.8 mL·min-1时，调整流动相体系与比例，盐酸伊伐布雷定与对映异构体的分离情况见表1。

表1 色谱条件筛选

2.3 色谱条件

综上实验结果，确定最终检测条件如下：

色谱柱：CHIRALPAK AD-H（4.6×250 mm，5 μm）；流动相：正己烷-异丙醇-三乙胺（60∶40∶0.1），等度洗脱；流速：0.8 mL·min-1；检测波长：286 nm；柱温：30℃；进样量：20 μL。

3 方法验证与结果

3.1 专属性定位实验

对映异构体溶液的配制：精密称定对映异构体对照品，以流动相为溶剂，配成每1 mL 中约含1.0 mg 的溶液，即得。

盐酸伊伐布雷定溶液配制：精密称定盐酸伊伐布雷定对照品，配成每1 mL中约含1.0 mg的溶液，即得。

混合溶液配制：精密称定盐酸伊伐布雷定与对映异构体对照品各约5 mg，置于100 mL量瓶中，以流动相为溶剂，溶解摇匀，即得。

测定：取上述各供试品溶液与流动相（空白）各20 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，定位试验结果见图3。

图3 盐酸伊伐布雷定与对映异构体混合溶液分离图

由上述实验结果可知：空白溶剂对对映异构体检测无干扰，主峰与对映异构体的分离度大于1.5，见图3，该方法专属性良好。

3.2 溶液稳定性实验

待测溶液：取盐酸伊伐布雷定适量，精密称定，用流动相溶解并稀释制成1.0 mg·mL-1的溶液。按照前述的色谱条件，在25℃放置0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h 和12 h分别进样20 μL，对对映异构体和主峰面积进行统计，结果见表2。

表2 待测溶液稳定性考查结果

表3 系统适用性试验溶液稳定性考查结果

3.3 系统适用性试验溶液稳定性

系统适用性试验溶液：取盐酸伊伐布雷定与对映异构体对照品各约5 mg，精密称定，置于100 mL 量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。按前述色谱条件，在25℃放置0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h和12 h分别进样20 μL，对对映异构体和主峰面积进行统计，结果见表4。

以上结果表明，待测溶液和系统适用性试验溶液在12 h内峰面积没有明显变化，说明本品在流动相中25℃放置至少12 h内构型不会发生转变。

3.4 对映异构体的线性与范围

贮备液的配制：精密称量对映异构体对照品约15 mg，置50 mL量瓶中，以流动相为溶剂溶解稀释至刻度，即得。

线性溶液的配制：精密量取上述溶液100 μL、200 μL、250 μL、400 μL、500 μL、600 μL 分别置于100 mL、100 mL、50 mL、50 mL、50 mL、50 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，即得。

精密量取上述溶液各20 μL，分别注入液相色谱仪测定，记录色谱图，以对映异构体进样量为x轴，峰面积为y 轴，对映异构体进样量在6.19～74.30 ng 范围内与峰响应值呈显著线性关系，对映异构体线性方程为y=1 157.50x-2 499.86，相关系数r 为0.999 5，具有良好的线性关系。

3.5 检测限与定量限实验

取对映异构体对照品适量，精密称定，置于100 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液，取上述溶液逐次稀释进样，进样体积20 μL，按信噪比（S/N）3∶1计算检测限，按信噪比（S/N）10∶1计算定量限，对映异构体的检测限质量为2.1 ng，相当于供试品浓度0.01%；定量限质量为4.7 ng，相当于供试品浓度0.02%，该方法灵敏度良好。

3.6 准确度实验

对映异构体按照供试液浓度的0.03%、0.15%、0.3%三个点配制样品，每份样品平行配制3 份，共9 份。按“2.3”下色谱条件注入液相色谱仪中，记录色谱图，按外标法计算对映异构体的含量与准确度。结果：平均准确度为94.05%，RSD小于5.0%，该方法准确度良好。

3.7 进样精密度与重复性实验

方法：分别取对映异构体与盐酸伊伐布雷定适量，以流动相为溶剂，配制成每1 mL 分别含有3 μg、10 μg样品的溶液，作为混合供试品溶液。按照上述色谱条件，精密量取该供试品溶液20 μL 注入液相色谱仪，记录色谱图，重复进样6次，以主峰与杂质峰面积计算，其RSD 均小于2.0%，进样精密度良好。

按上述制备方法，平行配制6 份混合供试品溶液，以主峰与杂质峰面积计算，其RSD 均小于2.0%（n=6），该方法的重复性良好。

3.8 样品异构体的测定

依“2.3”项色谱检测方法，取5批盐酸伊伐布雷定原料药，2 批盐酸伊伐布雷定参比制剂，对对映异构体进行检测。检测结果显示，5批盐酸伊伐布雷定原料对映异构体均未检出，2批盐酸伊伐布雷定参比制剂中分别检出对映异构体含量为0.03%、0.03%。

4 结论

本研究的分析方法对于盐酸伊伐布雷定对映异构体检测简便、准确、可行，分离效果理想，专属性强，灵敏度高，可作为异构体检测的质控方法。