伊伐布雷定延长离体心脏单相动作电位时程及其致心律失常作用

杨巧梅，梁玉芝, 杨威，丁燕生，任璐，黄思慧，卫晓红，吴林

伊伐布雷定延长离体心脏单相动作电位时程及其致心律失常作用

杨巧梅，梁玉芝, 杨威，丁燕生，任璐，黄思慧，卫晓红，吴林

目的：本研究在兔离体心脏模型上观察伊伐布雷定对心房和心室肌单相动作电位时程（MAPD）的影响及其在海葵毒素（ATX-Ⅱ）处理后的致心律失常作用。

方法：雌性新西兰兔离体心脏采用Langendorff系统进行灌流，记录左心耳和左心室内外膜动作电位，观察在固定频率起搏刺激周长为350 ms（对应的心率为171次/min）时，伊伐布雷定单独作用以及ATX-Ⅱ（3 nmol/L）作用下伊伐布雷定对心房肌和心室肌复极90%的单相动作电位时程（MAPD90）的影响。此外，观察伊伐布雷定减慢心率至自主心率为（156±10）次/min时，伊伐布雷定单独和ATX-Ⅱ（3 nmol/L） 作用下伊伐布雷定的致心律失常作用。

结果：伊伐布雷定（3～10 μmol/L）单独作用可显著延长心房肌、心室肌内膜和外膜的MAPD90，延长幅度分别为（15.9±2.0）ms、（31.5±4.0）ms和（23.9±3.0）ms（n=6， P＜0.01）。ATX-Ⅱ（3 nmol/L）可显著延长心房肌和心室肌MAPD90，延长幅度在心房肌为（36.5±5.0）ms（n=6，P＜0.01），而在心室肌内膜和外膜分别为（19.9±3.0）ms和（19.5±4.0）ms（n=6， P＜0.01）。在ATX-Ⅱ处理后的心脏，伊伐布雷定（6～10 μmol/L）可使心房肌MAPD90显著缩短（14.4±4.0）ms（n=6， P＜0.01），且可诱发房性心律失常；但在心室肌伊伐布雷定（3～10 μmol/L）显著延长心内膜和心外膜MAPD90，延长幅度分别为（36.2±7.0）ms和（27.5±5.0）ms（n=6， P＜0.01）。无论是否经ATX-Ⅱ处理，伊伐布雷定均不增加心室肌MAPD90的逐搏变异性和跨壁离散度，且无室性心律失常发生。

结论：伊伐布雷定可延长心房肌和心室肌MAPD。在晚钠电流增大后，伊伐布雷定可诱发房性心律失常，但不引起室性心律失常。

致心律失常作用；动作电位时程；晚钠电流；伊伐布雷定

Methods: The perfusion of isolated heart from female New Zealand white rabbit was conducted by Langendorff method in vitro. Left atrial and left ventricular endo- , epi-cardial action potential were recorded when pacing with fixed frequency of 350 ms (in correspondence with the heart rate of 171 times/min) to observe the effect of IVA alone and ATX-II (3 nmol/L) with IVA on MAPD90. In addition, to observe the action of IVA alone and ATX-II with IVA on proarrhythmia when IVA reducing the heart rate to autonomous cardiac rhythm as (156±10) times/min.

Results: IVA at (3-10) μmol/L prolonged atrial and ventricular endo- , epi-cardial MAPD90by (15.9 ± 2.0) ms, (31.5 ± 4.0) ms and (23.9 ± 3.0) ms (n=6, P＜0.01), respectively. ATX-II at 3 nmol/L prolonged atrial and ventricular MAPD90by (36.5 ± 5.0)

ms and (19.9 ± 3.0) ms, (19.5 ± 4.0) ms (n=6, P＜0.01) respectively. With ATX-II treatment, IVA at (6-10) μmol/L decreased atrial MAPD90by (14.4 ± 4.0) ms (n=6, P＜0.01), it induced atrial arrhythmia. With 3 nmol/L of ATX-II treated ventricle, IVA at (3-10) μmol/L obviously prolonged endo- and epi-cardial MAPD90by (36.2 ± 7.0) ms and (27.5 ± 5.0) ms (n=6, P＜0.01), respectively. IVA didn’t increase ventricular beat-to-beat variability and transmural dispersion of MAPD90no matter with or without ATX-II treatment, no ventricular arrhythmia occurred.

Conclusion: IVA prolongs both atrial and ventricular MAPD, with increased late sodium current, IVA may induce atrial arrhythmia but not ventricular arrhythmia in experimental rabbits in vitro.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:585.)

伊伐布雷定（ivabradine， IVA）是一种新型的选择性抑制窦房结细胞起搏电流（If）的药物，可减慢窦性心率，不影响血压、心肌的收缩和舒张功能以及心脏传导性，从而改善和消除不适当性窦性心动过速患者的症状[1，2]。伊伐布雷定不具有洋地黄、β受体阻滞剂与钙通道阻滞剂的负性肌力和负性房室传导的作用。据文献报道治疗剂量的伊伐布雷定主要抑制窦房结细胞If电流；高于治疗剂量时可抑制快速激活的延迟整流钾电流（IKr）[3]，延长心室复极，延长动作电位时程（action potential duration，APD）[4]。关于伊伐布雷定延长QT间期后的致心律失常的危险性并不明确。海葵毒素（sea anemone toxin-Ⅱ， ATX-Ⅱ）可增大晚钠电流，低浓度时可延长心室肌的单相动作电位时程（MAPD），导致心脏复极储备降低，不引起心律失常，但可增加并延长QT间期药物的致心律失常作用[5]，因此可用于探测低危延长QT间期药物的致心律失常的危险性[6]。本研究通过兔离体心脏模型观察了伊伐布雷定对心房和心室MAPD的影响，及在ATX-Ⅱ处理后的心脏上伊伐布雷定可能的致心律失常作用。

1 材料和方法

1.1 动物模型的制备

实验时间：2015-02至2015-03。本研究符合美国国立卫生研究院实验动物的应用指南，采用雌性新西兰白兔26只，购买于方元缘动物公司，体重2.5～3.5 kg。耳缘静脉注射戊巴比妥钠麻醉，开胸后取出心脏，采用Langendorff系统经主动脉进行灌流，灌流液为改良的Krebs-Henseleit缓冲液，组成成份为（单位mmol/L）：NaCl：118，KCl：2.8，KH2PO4：1.2，CaCl2：2.5，MgSO4：0.5，丙酮酸：2.0，葡萄糖：5.5，Na2EDTA：0.57，NaHCO3：25。温度为37℃，流速为20 ml/min。经连接在灌流系统侧面的压力传感器持续检测冠状动脉压。

在右心耳置入双极特氟龙加膜的起搏电极进行固定频率的起搏，观察刺激周长为350 ms（对应心率为171次/min）时，伊伐布雷定单独作用以及ATX-Ⅱ（3 nmol/L）处理后不同浓度的伊伐布雷定对心房肌和心室肌MAPD的影响。在自主心率较慢的心脏[（156±10）次/min]，分别观察伊伐布雷定单独作用和ATX-Ⅱ处理后的心脏伊伐布雷定的致心律失常作用。观察不同频率起搏下，伊伐布雷定对心房肌和心室肌MAPD及其反向频率依赖性的影响时，对无任何药物作用的心脏和伊伐布雷定单独处理后的心脏分别进行不同频率的起搏，刺激周长均依次由450 ms（窦性心率）缩短为400 ms、333 ms和286 ms，每个频率的起搏持续时间为3～4 min。为了更直接的观察伊伐布雷定在心室的致心律失常作用，采用文献[7-9]的方法进行房室结消融后1.0 Hz起搏，观察自发性及3 s或者5 s间歇后室性心律失常的发生。使用电刺激脉冲的波宽为3 ms，刺激电压的幅度为起搏阈值（1～5 V）的3倍。刺激仪选用Grass-S88X型刺激仪（Astro-Med公司，美国）。

1.2 心电信号的采集与测量

分别于左心耳远端和左心室基底部房室瓣下方的心室游离壁内外置放动作电位记录电极，记录左心房、左心室内膜和外膜单向动作电位（MAP），其中内膜电极于右心室游离壁约2/3与1/3交界处切入，穿破室间隔进入左心室心腔内与心内膜接触。心房和心室复极100%的MAP在计算机上观察到后通过Spike 6软件分析得复极90%的MAPD（MAPD90），12导联心电图采用具备Wilson终端的模拟的非接触式12导联心电图记录系统（Harvard Apparatus 公司）采集心电信号，所有心电信号进行连续检测并且经过Biopac心电放大系统处理后存储于计算机。心室复极的逐搏变异性：在恒定频率下，

连续测量30次心搏的心室肌外膜的MAPD90，通过以下公式计算: Σ|MAPDn+1- MAPDn|/[30×√2 ][7]。跨壁离散度：心室肌内膜和外膜的MAPD90的差值。

1.3 使用药物及给药方法

伊伐布雷定浓度为（0.01～10）μmol//L，ATX-Ⅱ浓度为（3 nmol/L）。ATX-Ⅱ使用生理盐水溶解，伊伐布雷定经二甲基亚砜和生理盐水溶解，均采用微量注射泵注入灌流系统。ATX-Ⅱ给药时间为15～20 min，伊伐布雷定达到最终起效时间为10 min，心脏灌流液中二甲基亚砜和生理盐水的浓度分别不超过0.1%和0.5%。

1.4 统计学分析

所有数据均采用均数±标准误表示，图形均采用Prism Version 5.0制作，同一心脏在药物治疗前后的数值采用重复测量的one-way多变量分析方法进行比较，Newman-Keuls检验比较各组均数之间是否有差异。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 伊伐布雷定减慢心率的作用

离体心脏基础窦性心率为（164±4）次/min，伊伐布雷定（0.06～10 μmol/L）可呈浓度依赖性显著减慢心率至（128±5）次/min（n=5，P＜0.05），差异有统计学意义。

2.2 伊伐布雷定单独作用对心房肌和心室肌MAPD90的影响

心房刺激周长为350 ms时（心率171次/min），心房肌、心室肌内膜和外膜的MAPD90分别为（49.6±3.0）ms、（136.3±7.0）ms和（127.4±4.0）ms。在此刺激周长下，伊伐布雷定（3～10 μmol/L）可呈浓度依赖性的显著延长心房肌和心室肌内膜及外膜MAPD90，延长幅度分别为（15.9±2.0）ms、（31.5±4.0）ms和（23.9±3.0）ms（n=6， P＜0.01）。在心房刺激周长为450 ms （132次/ min）时，正常心脏心室肌内膜和外膜MAPD90分别为（150.1±4.0）ms和（141.0±4.0）ms， 随着刺激周长逐渐缩短至286 ms，心室肌内膜和外膜MAPD90分别缩短（43.1±3.0）ms和（30.8±5.0）ms（n=5，P＜0.01）。伊伐布雷定（6 μmol/L）作用后随着刺激周长逐渐缩短，心室肌内膜和外膜MAPD90亦逐渐缩短，缩短幅度分别为（41.2±3.0）ms和（31.6±4.0）ms（n=5， P＜0.01）。可见，伊伐布雷定延长心室肌MAPD90的幅度与对照组相似，因此伊伐布雷定延长心室肌MAPD90不具有反向频率依赖性的特征。在各浓度及刺激频率下伊伐布雷定应用前后均无房性或室性心律失常发生。

2.3 伊伐布雷定在ATX-Ⅱ处理后心脏的致房性心律失常作用

心房刺激周长为350 ms时， ATX-Ⅱ（3 nmol/L）可显著延长心房肌和心室肌MAPD90，延长幅度在心房肌为（36.5±5.0）ms（n=6，P＜0.01），而在心室肌内膜和外膜分别为（19.9±3.0）ms和（19.5±4.0）ms（n=6， P＜0.01）。刺激周长不变（心率171次/min），在ATX-Ⅱ（3 nmol/L） 持续作用下，伊伐布雷定（6～10 μmol/L）可使心房肌MAPD90显著缩短（14.4±4.0）ms（n=6， P＜0.01），并且引起了自发性的房性心律失常（图1），心律失常在伊伐布雷定1 μmol/L和伊伐布雷定 3 μmol/L浓度下以房性心动过速（房速）、心房颤动（房颤）常见，在伊伐布雷定6 μmol/L和伊伐布雷定10 μmol/L则无房颤、房速发生。

图1 伊伐布雷定的致房性心律失常作用

为了证实伊伐布雷定引起的心率减慢可能增加药物的致心律失常作用，采用自主心率（无起搏）的心脏重复上述方案，结果证明在ATX-Ⅱ处理后

的心脏，使用接近于治疗浓度的低剂量伊伐布雷定（0.06～10 μmol/L）可使窦性心房率减慢至（156±10）次/min时，房性心律失常的发生率增高。

在心室，经 3 nmol/LATX-Ⅱ处理后，伊伐布雷定（3～10 μmol/L）显著延长心内膜和心外膜MAPD90，延长幅度分别为（36.2±7.0）ms和（27.5±5.0）ms（n=6，P＜0.01），即在ATX-Ⅱ处理后的心脏，伊伐布雷定延长心室肌MAPD的幅度与单独应用伊伐布雷定时相似，浓度效应曲线与伊伐布雷定单独作用时是平行关系，提示伊伐布雷定延长心室肌MAPD的作用与ATX-Ⅱ呈相加作用。在心室肌1.0 Hz起搏时，经ATX-Ⅱ（3 nmol/L）处理后，伊法布雷定 （0.06～10 μmol/L）在3 s间歇和5 s间歇后均无室性心律失常发生（图2）。此外，基础状态下心室肌MAPD90的逐搏变异性和跨壁离散度分别为（1.4±0.3）ms和（15.6±2.6）ms，而无论伊伐布雷定单独作用或者在ATX-Ⅱ处理后的心脏，伊伐布雷定（1～10 μmol/L）均不增加心室复极的逐搏变异性和跨壁离散度，分别为（1.2±0.2）ms和（1.4±0.1）ms，（20.2±3.0）ms和（20.6±2.9）ms（n=6， P＞0.05）。

图2 伊伐布雷定对室性心律失常的影响

3 讨论

伊伐布雷定（0.06～10 μmol/L）可呈浓度依赖性显著减慢窦性心率。伊伐布雷定（3～10 μmol/L）可显著延长心房肌、心室肌内膜和外膜MAPD90，具有浓度依赖性和反向频率依赖性的特征。晚钠电流增强剂ATX-Ⅱ可延长心房肌、心室肌内膜和外膜的MAPD90，在ATX-Ⅱ处理的心脏，伊伐布雷定（6～10 μmol/L）缩短心房肌MAPD90，且引起了自发性房性心律失常。在心室，无论伊伐布雷定单独作用还是在ATX-Ⅱ处理的心脏，伊伐布雷定延长心室肌内膜和外膜MAPD90的幅度相似，不增加心室肌MAPD90的逐搏变异性和跨壁离散度，无室性心律失常发生。

本研究在兔离体心脏模型观察到伊伐布雷定（0.06～10 μmol/L）在治疗浓度范围内显著减慢窦性心率的作用。由于离体心脏是去交感与副交感神经的心脏，心率不受交感和迷走神经的影响，因此实验中记录的心率是兔的固有心率，伊伐布雷定显著减慢窦性固有心率是由于伊伐布雷定作用于窦房结If电流所致，这与之前的基础和临床试验的研究结果相一致[10，11]。

伊伐布雷定（3～10 μmol/L）可显著延长心室肌内膜和外膜MAPD90，且具有浓度依赖性的特征，因此本文探查了伊伐布雷定是否有潜在的致心律失常的危险性。伊伐布雷定（IC50=2.8 μmol/L）特异性抑制人窦房结细胞的If电流，但高于治疗浓度时可抑制IKr，IC50为4.9 μmol/L[12]。本研究中3 μmol/L及以上的伊伐布雷定延长心室MAPD90可能是由于抑制IKr所致。IKr为决定心室复极的主要离子通道，抑制IKr的药物（如：Ⅲ类抗心律失常药物，大环内酯类和喹诺酮类的抗生素等）可导致心脏复极储备降低，QT间期延长，增加室性心律失常的发生率。因此，具有IKr抑制作用的药物有潜在的致心律失常危险性，是临床应用中应积极关注的问题。此外，伊伐布雷定本身具有的减慢窦性心率的作用，是复极储备降低的促进因素之一。本文对正常心脏在晚钠电流增大后进行研究表明：伊伐布雷定虽延长MAPD（对应心电图的QT间期），但不引起室性心律失常，原因分析如下：Wu等[6]的研究已经证实在ATX-Ⅱ致敏的心脏可探测低危延长QT间期药物的致心律失常作用，因此有潜在致心律失常作用的药物在治疗浓度下可诱发心律失常。本研究中，伊伐布雷定单独作用或者ATX-Ⅱ处理后的心脏，伊伐布雷定延长心室肌MAPD90幅度相似，且无论

是否经ATX-Ⅱ作用，伊伐布雷定均不增加心室肌MAPD90的逐搏变异性和跨壁离散度。APD及其逐搏变异性和跨壁离散度的增加均与尖端扭转型室速的发生相关[8]，其预测药物致心律失常作用的价值高于QT间期及其他指标。并且，即使MAPD90延长，逐搏变异性不增加，尖端扭转型室速的发生几率亦很小[7]，因此可作为本研究中无室性心律失常发生的原因之一。此外，可抑制IKr具有致心律失常作用的药物在晚钠电流增大（ATX-Ⅱ处理）的心脏延长MAPD的作用显著增大，多数具有致心律失常作用的IKr抑制剂与晚钠电流增大呈协同作用[6，7]。本研究结果表明，伊伐布雷定在晚钠电流增大的心脏延长MAPD的作用与伊伐布雷定单独作用相似，提示伊伐布雷定与ATX-Ⅱ延长MAPD的相互作用是相加作用而非协同作用，类似于雷诺嗪和酚妥巴比妥[9]，伊伐布雷定不引起室性心律失常的机制可能与此也有关。本结果可能提示在生理及可引起晚钠电流增大的病理情况（心力衰竭、心肌缺血和心肌肥厚等）下[4]，稍高于治疗剂量的伊伐布雷定均不导致室性心律失常的发生。

伊伐布雷定（3～10 μmol/L）可显著延长心房肌MAPD90，与心室肌相似，伊伐布雷定单独作用延长心房肌MAPD可能是由于抑制IKr所致。而在ATX-Ⅱ处理后，与伊伐布雷定单独作用相比，伊伐布雷定（6～10 μmol/L）显著缩短心房肌MAPD90，并可导致房性心律失常发生，且心率越慢心律失常的发生率越高。因此伊伐布雷定减慢心率的同时可增加房性心律失常的危险性。有研究证实在兔肺静脉细胞和人心房肌细胞中，If电流可参与触发活动并诱发房颤，且伊伐布雷定在3.5 μmol/L及以上的剂量可呈浓度依赖性地抑制心房肌细胞中上调表达的If电流[13-15]。有临床研究发现伊伐布雷定作用后房颤的危险性可达15%[16]。这些研究结果与本实验的结果相一致，即伊伐布雷定在1～3 μmol/L出现房颤、房速，而在6 μmol/L及以上的剂量，房颤、房速消失。目前伊伐布雷定与房颤发生的具体机制及在ATX-Ⅱ处理的心脏伊伐布雷定引起心房肌MAPD缩短的原因尚不清楚，有待我们进一步的研究。

伊伐布雷定单独作用可延长心房肌和心室肌MAPD90。无论在正常心脏还是晚钠电流增大心脏，伊伐布雷定延长心室肌MAPD90的幅度与伊伐布雷定单独作用相似，且不具有致室性心律失常的作用。与此相比，当晚钠电流增大后，伊伐布雷定可能导致房性心律失常的发生，并且随着心率的减慢，房性心律失常发生的危险性增加。本研究表明伊伐布雷定不具有致室性心律失常作用，但有潜在的引起房性心律失常的危险性。

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Effect of Ivabradine Prolonging the Cardiac Action Potential Duration With its Proarrhythmic Action in Experimental Rabbit in vitro

YANG Qiao-mei, LIANG Yu-zhi, YANG Wei, DING Yan-sheng, REN Lu, HUANG Si-hui, WEI Xiao-hong, WU Lin.
Department of Cardiology, Peking University First Hospital, Beijing (100034), China

Objective: To observe the effect of ivabradine (IVA) on atrial and ventricular monophasic action potential duration (MAPD) and its proarrhythmic action at presence of sea anemone toxin-II (ATX-II) in isolated rabbit heart model in vitro.

Proarrhythmia action; Action potential duration; Late sodium current; Ivabradine

2015-01-21）

（编辑：漆利萍）

国家自然科学基金资助项目（81270253）

100034 北京市，北京大学第一医院 心内科 分子心血管学教育部重点实验室（杨巧梅、杨威、丁燕生、任璐、黄思慧、卫晓红、吴林）；河南省商丘市人民医院（梁玉芝）

杨巧梅 硕士研究生 研究方向为心电生理与心律失常 Email: 742619322@qq.com

吴林 lin_wu@163.com

R541

A

1000-3614（2015）06-0585-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.06.019