陈自喜 李锦澎 郑 瑾 相芬芬 康向东 吴 蓉
上海中医药大学附属普陀医院检验科,上海 200062
慢性乙型肝炎是常见的感染性疾病,乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)在体内长期持续复制导致疾病慢性化,从而严重危害患者的健康[1-2]。免疫反应介导细胞因子活化、增殖在HBV DNA 长期复制中发挥重要作用[3]。机体T 淋巴细胞亚群失衡,免疫功能发生紊乱,不能及时有效地识别、清除入侵的HBV 可导致疾病的长期化、慢性化[4-6]。目前临床有效诊断肝细胞损伤的金标准主要借助肝脏酶等,通过对肝脏酶检测及时有效地评估肝细胞损伤程度并改善乙型肝炎患者的治疗及预后。本研究通过检测慢性乙型肝炎患者血清HBV 载量、炎症因子、外周血T 淋巴细胞亚群、肝脏酶的表达,进一步探究机体感染HBV 后患者血清病毒载量与机体免疫功能变化关系。
收集2019 年3 月至2022 年8 月上海中医药大学附属普陀医院(以下简称“我院”)收治的经临床确诊为慢性乙型肝炎的患者85 例。根据HBV 载量,将其分为HBVDNA 阴性组(HBVDNA<103IU/ml)(29例),HBV DNA 低载量组(HBV DNA 103~105IU/ml)(28 例)和HBV DNA 高载量组(HBV DNA>105IU/ml)(28例)。纳入标准:经临床诊断为慢性乙型肝炎患者。排除标准:患有自身免疫系统性疾病、代谢性疾病、急性药物肝损伤。本研究通过我院伦理委员会批准(PTEC-A-2021-28-1)。
实时荧光定量PCR 扩增仪购自上海宏石医疗科技有限公司(SLAN-96P);HBV DNA 检测试剂盒(22028-2)购自湖南圣湘生物医学科技有限公司。具体操作流程按试剂说明书进行,正常的HBV DNA 病毒载量参考范围<1 000 IU/ml。淋巴细胞亚群检测抗体(89173)和BD Trucount 绝对计数管(2236937)购自美国BD 公司上海有限公司。流式细胞仪购自美国BD 公司上海有限公司(BD FACSCanto2)。白细胞介素(interleukin,IL)-6(C22050118)、IL-8(C22010111)、IL-10(C22010118)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)(C22010119)试剂均购自热景(廊坊)生物技术有限公司,细胞因子测定仪器为热景C2000。应用BECKMAN COULTER 全自动生化仪(AU5831)检测谷丙转氨酶(glutamic-pyruvic transaminase,GPT)(AUZ 0960)及谷草转氨酶(glutamic-oxaloacetic transaminase,GOT)(AUZ0157),具体操作流程按说明书进行。
1.3.1 HBV DNA 载量 所有研究对象于清晨空腹抽取外周静脉血5 ml,室温静止后,于4℃,转速3 500 r/min,离心半径13.5 cm 的条件下离心15 min。反应体系:标本+49 μl PCR 扩增液+1 μl 反应酶;反应条件:50℃UNG 酶反应2 min,95℃Taq 酶活化2 min,95℃变性15 s,58℃退火延伸30 s,共45 个循环。
1.3.2 外周血淋巴细胞亚群细胞数 所有研究对象于清晨空腹抽取5 ml 外周静脉血,吸取50 μl 全血,加入绝对计数管中,并加入20 μl 荧光素标记的鼠抗人单克隆抗体CD45/CD3/CD4/CD8 混匀,室温避光20 min,加入450 μl 1×BD 溶血素混匀,于1 h 内采用流式细胞仪检测。
1.3.3 血清中炎症因子和GPT、GOT 水平 所有研究对象于清晨空腹抽取外周静脉血5 ml,室温静止后,于4℃,转速500 r/min,离心半径13.5 cm 的条件下离心15 min,按照试剂盒说明书操作,检测血清IL-6、IL-8、IL-10、TNF 表达,另采用全自动生化仪酶学法检测GPT、GOT 水平。
采用SPSS 26.0 统计学软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差()表示,多组计量资料比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t 检验。采用Pearson 相关数分析相关性。以P<0.05 为差异有统计学意义。
HBV DNA 阴性组男16 例,女13 例;年龄50~62岁,平均(56.59±2.70)岁;HBV DNA 低载量组男19 例,女9 例;年龄41~74 岁,平均(56.43±10.66)岁;HBV DNA 高载量组男22 例,女6 例;年龄43~74岁,平均(59.62±9.38)岁。三组一般资料比较,差异无统计学意义(P>0.05)。
HBV DNA 低、高载量组IL-6、IL-8、IL-10、TNF水平高于HBV DNA 阴性组,HBV DNA 高载量组IL-6、IL-8、IL-10、TNF 水平高于HBV DNA 低载量组(P<0.05)。见表1。
表1 三组炎症因子水平比较(pg/ml,)
表1 三组炎症因子水平比较(pg/ml,)
注 与HBV DNA 阴性组比较,aP<0.05;与HBV DNA 低载量组比较,bP<0.05。HBV:乙型肝炎病毒;IL:白细胞介素;TNF:肿瘤坏死因子。
HBV DNA 低、高载量组CD4+百分率、CD4+绝对计数、CD3+绝对计数、CD4+/CD8+低于HBV DNA 阴性组,CD8+百分率及其绝对计数高于HBV DNA 阴性组(P<0.05)。HBV DNA 高载量组CD4+百分率、CD3+绝对计数、CD4+绝对计数、CD8+绝对计数、CD4+/CD8+低于HBV DNA 低载量组,CD8+百分率高于HBV DNA 低载量组(P<0.05)。见表2。
表2 三组T 淋巴细胞亚群比较()
表2 三组T 淋巴细胞亚群比较()
注 与HBV DNA 阴性组比较,aP<0.05;与HBV DNA 低载量组比较,bP<0.05。HBV:乙型肝炎病毒。
HBV DNA 低、高载量组的GPT、GOT 水平均高于HBV DNA 阴性组,HBV DNA 高载量组GPT、GOT 水平高于HBV DNA 低载量组(P<0.05)。见表3。
表3 三组血清肝脏酶水平比较(U/L,)
表3 三组血清肝脏酶水平比较(U/L,)
注 与HBV DNA 阴性组比较,aP<0.05;与HBV DNA 低载量组比较,bP<0.05。HBV:乙型肝炎病毒;GPT:谷丙转氨酶;GOT:谷草转氨酶。
慢性乙型肝炎患者血清IL-6、IL-10、TNF 水平与GPT 水平呈正相关(r=0.63、0.45、0.61,P<0.001),IL-8与GPT 无相关性(r=0.17,P=0.120)。IL-6、IL-10、TNF水平与GOT 水平呈正相关(r=0.48、0.40、0.49,P<0.001),IL-8 与GOT 无相关性(r=0.08,P=0.440)。
慢性乙型肝炎机制是指机体受到HBV 侵袭、感染不能及时有效清除HBV,使机体长期陷入免疫耐受状态,造成患者肝细胞、肝组织等的慢性破坏、损伤。研究证实,是由于机体免疫损伤造成[7-9]。慢性乙型肝炎发病机制与患者遗传、年龄、肝组织及细胞内炎症因子活化有关,而机体炎症因子在免疫系统的调控中发挥重要作用[10-12]。肝脏含丰富的肝巨噬细胞,病原体攻击肝细胞后,肝细胞内炎症级联反应被激活,促使机体释放大量炎症因子如IL-6、TNF 等[13-16],诱导机体产生一连串的免疫级联反应,TNF 加剧肝星状细胞增殖,使肝巨噬细胞释放转化生长因子-β、血小板生长因子等,同时TNF 刺激产生大量IL-6 促使中性粒细胞聚集、活化,诱发肝纤维化和肾小管坏死等[17-19],释放的IL-8 等趋化中性粒细胞进入炎症组织,产生超氧阴离子,激活炎症细胞,参与炎症反应发生,促进肝纤维细胞增殖分化,进一步导致慢性乙型肝炎发生[20-22]。
本研究结果显示,HBV DNA 低、高载量组IL-6、IL-8、IL-10、TNF 水平高于HBV DNA 阴性组,HBV DNA 高载量组IL-6、IL-8、IL-10、TNF 水平高于HBV DNA 低载量组,提示机体受到HBV DNA 病毒复制增多,机体免疫炎症因子的活化增强,进一步提示肝脏器官已经损伤。目前临床评估肝细胞受损程度的金标准是肝脏酶GPT、GOT 等的水平,本研究结果显示,HBV DNA 低、高载量组GPT、GOT 水平均高于HBV DNA 阴性组,HBV DNA 高载量组GPT、GOT 水平高于HBV DNA 低载量组。相关性结果显示,炎症因子IL-6、IL-10、TNF 与肝脏酶GPT、GOT 呈正相关,可能是随着HBV DNA 不断复制,病毒载量升高,肝细胞受损,细胞通透性增加,转氨酶和释放的炎症细胞因子相互反应促使机体出现免疫级联反应。因此,慢性HBV 病情评估应结合肝功能酶、炎症因子综合分析,获得更为准确且客观的参考依据。
外周血T 淋巴亚群在机体特异性免疫应答中发挥关键作用,是慢性乙型肝炎患者免疫状态的监测指标之一。T 淋巴亚群中CD4+T 细胞促进免疫细胞增殖和分化,调节机体细胞和体液免疫[23-25]。CD8+T 具有很强的杀伤能力,是机体清除细胞内病毒的重要免疫细胞[26]。本研究结果显示,与HBV DNA 阴性组比较,HBV DNA 低、高载量组CD4+T 细胞百分率和绝对计数减少,CD8+T 细胞百分率和绝对计数增加,CD4+/CD8+降低,提示机体产生的特异性抗体不足,不能及时有效地清除HBV,造成HBV DNA 在机体内不断复制。CD4+/CD8+是监测机体细胞免疫功能、反映机体免疫状态的重要指标,随着复制的HBV DNA 载量升高,CD4+/CD8+失衡,提示HBV DNA 不断复制导致机体免疫系统发生严重紊乱。
综上,诊治慢性乙型肝炎应结合肝脏酶、炎症因子和外周血T 淋巴细胞亚群等指标分析,获得更为准确且客观的参考依据,为患者制订更为有效的治疗方案改善预后。