基于生物信息学方法的骨肉瘤预后相关甲基化调控差异表达基因筛选

戴 易 张志敏 岳 星 青恒臻 袁长深 段 戡 郑杭彬

1.广西中医药大学研究生院，广西南宁 530022；2.广西中医药大学第一附属医院骨科，广西南宁 530023；3.联勤保障部队第九一〇医院重症监护病房，福建泉州 362000

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是一种间充质细胞源性恶性肿瘤，常见于儿童和青少年[1]。OS 好发于股骨远端、胫骨和肱骨的近端[2]，患者常表现为疼痛、肿胀，甚者伴病理性骨折[1]。25%的OS 患者伴有癌细胞转移，其中最常见转移是肺部，其次是骨骼远端[2-3]。目前，OS 无转移患者5 年无事件生存率（event-free survival，EFS）约为70%，而转移患者仅为30%[4]。OS 的治疗措施主要包括化疗和手术[5]，研究表明，化疗联合手术可显著提高OS 生存率，然而，转移性OS 预后生存较差，在治疗中存在药物副作用[6]。

表观遗传是指所有独立于DNA 序列基因表达的调控机制，其主要过程为ATP 依赖型染色质重塑、非编码RNA 调控、组蛋白修饰、DNA 甲基化[7]。其中DNA 甲基化是指在其转移酶调控下，CpG 序列5-胞嘧啶选择性添加甲基基团从而形成5-甲基胞嘧啶的共价化学修饰过程[8-9]。DNA 甲基化能改变染色体结构、DNA 构象、DNA 稳定性及蛋白质与DNA 相互作用方式，从而调控基因表达[10-11]。近年来研究表明，DNA 甲基化可能是各种恶性肿瘤潜在预后靶标[4]。在癌细胞中，肿瘤抑制基因启动子区域高甲基化可以导致细胞异常增殖，从而引发癌症[6]。此外，异常DNA 甲基化也与神经、免疫系统疾病、动脉粥样硬化和骨质疏松有关[12]。本研究筛选OS 患者异常甲基化差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），目的是阐明DNA 甲基化在OS 进展中的作用，以期为治疗OS 提供新靶标。

1 资料与方法

1.1 数据资料

在基因表达综合数据库中检索得到芯片GSE36001和GSE36002，GSE36001 包含19 个骨肉瘤样本与6个正常样本，GSE36002 包含19 个甲基化骨肉瘤样本与6 个甲基化成骨细胞样本[13]。

1.2 OS 患者DEGs 及甲基化DEGs 筛选

利用R 语言筛选芯片DEGs。①GSE36001：利用校正后P＜0.05 筛选OS 患者的DEGs，其中logFC＞1为上调DEGs，反之为下调DEGs；②GSE36002 中利用校正后P＜0.05 筛选OS 甲基化DEGs，其中t＞2 为高甲基化DEGs，反之为低甲基化DEGs。基于Venny 平台，将上调DEGs 与低甲基化DEGs 取交集，下调DEGs与高甲基化DEGs 取交集，再将两交集取并集，得到OS 特异性甲基化DEGs 并对其进行可视化分析。

1.3 甲基化DEGs 的GO 及KEGG 富集分析

基于David 6.8 数据库，以P≤0.05 为过滤条件，分别对高、低甲基化DEGs 集进行GO 和KEGG 分析，运用R 语言可视化分析前20 条富集条目。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络构建

通过STRING 数据库设定筛选阈值为0.4 获得OS 特异性甲基化DEGs 的PPI 网络，再将其数据导入Cytoscape 3.6 软件，使用CytoHubba 插件对其进行拓扑分析，根据介数中心性、度值、紧密度、马修斯相关系数筛选核心DEGs。

1.5 核心基因预后生存分析

利用R2 平台，对核心DEGs 使用Kaplan-Meier法预估患者生存时间，并生成生存曲线，以P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OS 特异性甲基化DEGs 分析

OS 样本包含3 433 个高甲基化区域和2 212 个低甲基化区域。在GSE36001 和GSE36002 中，将基因集下调DEGs 与高甲基化DEGs 取交集得到128 个下调的OS 高甲基化DEGs，基因集上调DEGs与低甲基化DEGs 取交集得到44 个上调的OS 低甲基化DEGs，将两个交集取并集得到OS 特异性甲基化DEGs 172 个，并对172 个基因进行可视化。见图1。

图1 GSE36001 和GSE36002 中172 个特异性甲基化差异表达基因

2.2 OS 患者特异性甲基化DEGs 的GO 及KEGG 富集分析

GO 分析结果显示，OS 高甲基化DEGs 主要参与表皮发育和皮肤细胞分化、体液免疫反应、角质形成与细胞分化等生物过程。OS 低甲基化DEGs 主要参与细胞分化、离子跨膜转运调节、跨突触信号传导调节等生物过程。KEGG 结果显示，OS 高甲基化DEGs包括细胞因子-细胞因子受体相互作用、病毒蛋白与细胞因子及其受体的相互作用、Toll 样受体（Toll-like receptors，TLR）、细胞色素P450 等通路；OS 低甲基化DEGs 包括Ca2+、MAPK、cAMP、癌症中的蛋白聚糖等通路。见图2～3。

图2 骨肉瘤患者高甲基化基因GO 和KEGG 富集分析条形图

图3 骨肉瘤患者低甲基化基因GO 和KEGG 富集分析条形图

2.3 PPI 网络

利用172 个特异性甲基化DEGs 构建PPI 网络，获得8 个核心基因。见图4。8 个核心基因参数见表1，其中RAC2 和PLEK 为下调高甲基化DEGs，其余为上调低甲基化DEGs。

表1 核心基因甲基化差异表达基因参数

图4 核心甲基化差异表达基因蛋白质-蛋白质相互作用网络

2.4 预后生存分析

ALOX5AP、HCK、LAPTM5、RAC2、LCP2、AIF1、TYROBP 和PLEK 高表达的OS 患者生存率高于低表达患者，差异有统计学意义（P=0.027、0.027、0.002、0.023、0.024、0.019、0.029、0.027）。见图5～6。

图6 LCP2、AIF1、TYROBP、PLEK 基因骨肉瘤患者的生存曲线

3 讨论

在GEO 中，OS 样本包含3 433 个高甲基化区域和2 212 个低甲基化区域，通过GO 和KEGG 分析揭示TLR、细胞色素P450、MAPK 通路富集较为明显。TLR 是一种细胞膜结合受体，其参与了细胞炎症反应过程[14]。研究表明，胰腺微生物组在启动信号级联反应中可能通过TLR4 激活胰腺肿瘤细胞促进炎症因子白细胞介素1β 的产生而发挥重要作用[15]。而肿瘤坏死因子-α 和白细胞介素1 等多种炎症细胞因子参与了OS 进展[16]。此外，TLR9 可以识别细菌基因组和病毒DNA 中未甲基化的CpGDNA。浆细胞样树突状细胞和B 细胞中TLR9 可以激活Thelper-1 型免疫应答和抗肿瘤活性。当通过招募髓样分化因子MyD88激活的TLR9 与内体中配体结合后，可以诱导促炎性细胞因子和Ⅰ型干扰素分泌[17]。Dhaini 等[18]发现，细胞色素P450CYP3A4/5 的高表达可能提示OS 的转移和不良预后，表明其作为OS 靶标的潜力。此外，细胞色素P450 酶可以代谢类固醇、脂肪酸、药物、毒素和致癌物[19]。Trujillo-Paolillo 等[20]发现，毗邻肺转移的OS中CYP1A2 过表达，提示CYP1A2 在OS转移过程中重要作用，OS 及其转移瘤标本中CYP3A4的表达低于正常骨组织，然而化疗后，OS 标本中CYP3A4 表达升高，提示CYP3A4 在OS 中的调控作用。因此，CYP1A2 和CYP3A4 在化疗药物代谢中的作用可能与化疗后的EFS 和治疗反应有关。

MAPK 通路在OS 进展中具有重要作用。经β-异硫氰酸苯乙酯（β-phenethyl isothiocyanate，PEITC）治疗后，OS 细胞MAPK 家族蛋白（ERK、P38、JNK）被激活，证明PEITC 通过诱导氧化应激反应使OS 细胞发生凋亡、自噬[21]。研究表明，特异性硫酸肝素蛋白聚糖和硫酸肝素生物合成酶的表达与OS 患者不良预后有关系[22]。此外，唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素15（sialic acid binding ig like lectin-15，Siglec-15）在OS鼠模型中过表达能促进肿瘤细胞生长、迁移和侵袭。当Siglec-15 表达被抑制时，双特异性磷酸酶介导的p15/MAPK 和JNK/MAPK 表达的抑制减弱，表明Siglec-15通过抑制双特异性磷酸酶介导的MAPK 途径影响OS进展[23]。

本研究中，基于R2 平台在无肿瘤转移情况下，核心甲基化DEGs 高表达OS 患者的生存率高于低表达OS 患者，提示基因差异表达水平对OS 患者生存预后有影响。研究表明，在OS 细胞中HCK 表达异常上调，HCK 可能通过MEK/ERK 通路干预OS 进展，HCK 表达下调降低了p-MEK 和p-ERK 的蛋白水平，促进跨膜糖蛋白钙黏素的积累，提示HCK 通过调节EMT 过程参与OS 进展[24]。因此，HCK 可能成为治疗OS 潜在靶点。基因RAC2 在细胞存活、增殖及周期进展等生物过程中发挥关键作用[25-26]。Shao 等[27]对RAC2 表达和骨髓增生异常综合征的研究显示，与正常组比较，OS 组RAC2 表达更高，说明RAC2 与骨髓增生有关。LCP2 在T 细胞发育和激活中起关键作用[28]，而T 细胞的介导抑制肿瘤细胞繁殖[29]。生物信息学研究表明，LCP2 可能在肿瘤的发生和转移中发挥作用，如结肠癌[30-31]和多形性胶质母细胞瘤[32]。AIF1 是一种炎症因子，其通过激活p38-MAPK 通路可导致乳腺癌细胞中肿瘤坏死因子-α 表达上调，从而促进乳腺癌细胞迁移[33]。Lv 等[21]发现，PEITC 通过激活MAPKs 通路，诱导OS 细胞凋亡。这些研究提示AIF1 可能通过激活MAPKs 通路，促进OS 细胞凋亡。研究表明，TYROBP 参与了T 细胞、B 细胞和巨噬细胞等多种免疫细胞的激活过程[34-35]。在生理条件下，小胶质细胞中表达的TREM2 受体与配体结合，再与TYROBP 相连接可诱导SYK 激酶的产生[36]，TYROBP 磷酸化可生成SYK 磷酸化底物，从而影响细胞生存[37]。有报道称，TYROBP 参与了OS 免疫微环境相关的发病机制，其与各种免疫细胞表面受体结合，从而介导信号传递和细胞激活的生物过程。而富集在破骨细胞中TYROBP可以导致肿瘤细胞凋亡并影响肿瘤周围的骨吸收[38]。

本研究基于生物信息学分析筛选得出8 个核心基因，作为OS 预后的重要靶标，在一定程度上为OS研究和治疗提供新的方向和理论依据。