传统蛋白免疫印迹技术常见异常结果及影响因素探究

洪铸　夏倩　聂昌　王龙　杜春艳

【摘要】  蛋白免疫印迹技术（western blotting，WB）是检测蛋白质经济、有效的方法，已广泛应用于分子相关的领域，但其影响因素多、操作复杂，常出现异常结果。本研究使用传统蛋白免疫印迹技术法检测（Sprague-Damley，SD）大鼠肝脏、脾脏组织某些蛋白质的表达，分析探讨常见异常结果及处理方法，为实验室和其他实验者提供参考。

【关键词】  蛋白免疫印迹技术；  抗体；  SDS-PAGE

中图分类号：R-331        文献标识码：A

文章编号：1672-1721（2023）28-0089-03

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.28.030

蛋白免疫印迹技术（WB）是检测组织、细胞中蛋白质表达并使之可视化的有效方法，最早在1979年由H.Towbin等[1]提出，后于1981年首次被W.N.Burnette等[2]称为Western blotting并沿用至今。WB法目前已作为分子生物学的常规实验方法，被广泛使用、刊登及讨论，其基本思路是将煮沸失活的蛋白样品置于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（sodium dodecyl sulface polyacry lamide gel electrophoresis，SDS-PAGE gel）中进行电泳以分离不同分子量的蛋白质，之后按照蛋白分子量标记物（如彩虹marker）将目的区域的凝胶和内参凝胶切下，并将其上的蛋白通过电流转移至较为稳定的载体膜上，再用目标抗体和内参抗体孵育，次日用对应的含有标记物的第二抗体孵育，用标记物的底物进行反应后曝光，最后使用目标蛋白和内参蛋白的阴影比值作为相对表达量得出结果。其理论检测下限可达1～5 ng，较其他检测方法而言，经济性较好，但操作流程较为复杂，实验持续时间长，影响因素较多。本研究针对遇到的8类常见异常结果及处理方法分析讨论，为其他实验者提供参考。

1    材料与方法

1.1    材料    组织样本来源：雄性SD大鼠，清洁级，取脾脏、肝脏。主要实验试剂与仪器：3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）第一抗体、GATA第一抗体由abcam生物技术有限公司生产。FKLF第一抗体、p-JNK第一抗体、ACTIN第一抗体、HRP第二抗体由北京博奥森生物技术有限公司生产。丙烯酰胺、RIPA裂解液、彩虹maker、BCA蛋白定量试剂盒由索莱宝生物科技有限公司生产。ECL曝光液由常州天地人和生物生产。ChemiDoc化學发光成像分析系统由BIO-RAD公司生产。

1.2    方法    蛋白上样液制作：使用RIPA蛋白裂解液裂解组织，按BCA蛋白定量法计算并制作蛋白样品，上样缓冲液中蛋白终质量浓度均定为40 mg/10 mL。SDS-PAGE电泳：配制SDS-PAGE凝胶及上层胶，取10 μL蛋白样品、彩虹marker上样，使用80 V电压电泳至彩虹marker分离出彩色条带后调节电压为120 V电泳直至蛋白样品触底。湿法转膜、封闭：将凝胶取出以300 mA电泳条件转移至聚偏二氟乙烯（polyving lidene fluoride，PVDF）膜；孵育第一抗体、第二抗体后使用ECL工作液曝光取像[2]。

2    异常结果分析及处理建议

2.1    背景色过深    如图1所示，过深的背景色与封闭异常相关，可适当延长封闭时间以竞争洗脱膜上的杂蛋白，但封闭时间过长，亦可使得目标蛋白信号减弱。封闭液及用于洗涤的TBST缓冲液如果有不明沉淀物或絮状浑浊，应及时更换，封闭液中使用的脱脂奶粉需要保持干燥，而且封闭时间过长且未洗净亦可能导致此结果。目前主流图像分析软件可降低背景显色，但可能会影响目的条带的分析。

2.2    曝光后显示无条带    如图2所示，曝光出现空白可能原因有：转膜失败，转膜时间或电流不适宜，蛋白质尚未进入或已穿出PVDF膜，需更换转膜条件；第一抗体、第二抗体浓度过低或失效，无法显色，需逐一尝试提高抗体浓度或更换抗体；样本本身表达目标蛋白过低，可尝试依据内参蛋白适当提高样本蛋白浓度；ECL曝光液失效，尤其在多张样片同时曝光时，曝光液使用后见光时间长易失效且反复使用使其效应减弱，需更换曝光液；操作人员因经验不足，未从宽裁剪凝胶，将目的条带意外切去，或切去部分导致无法分析。

2.3    出现较多条带    如图3所示，无论是选择多克隆抗体还是单克隆抗体，亦或样本是组织或是细胞株，均有可能出现多条带。目前处理方法争议较大，可按抗体说明书选择接近目标分子量的条带，或综合分析处理所出现的所有条带。

2.4    带墨点的无规律条带    如图4所示，在实验中多次更换其他实验条件但反复出现不能解释的墨点状堆积而条带不明显，可能是抗体失效所致，需要更换抗体。此外，封闭液中的奶粉未完全溶解也可能导致异常墨点。

2.5    未选择合适浓度的胶导致异常阴影出现    如图5所示，由于蛋白质分子量不同，需选择适宜浓度的胶分离不同分子量的目的蛋白，蛋白分子量越大，则需要选择浓度越低的胶；浓度过低的胶可能无法准确显示胶下方的分子量。

2.6    结果中出现未明原因的白色无抗体覆盖区域    如图6所示，可能原因是转膜过程中PVDF膜与胶之间出现气泡，导致蛋白转丢，或在使用TBST清洗时直接浇在膜上冲洗掉抗体。

2.7    无法曝光或者过亮曝光    如图7所示，主要由于第一抗体、第二抗体浓度过高超出仪器检测范围，导致仪器无法曝光或者过亮曝光显示出条带处为空白而无法分析。需适当降低抗体浓度，并降低曝光时间。

2.8    胶过度电泳导致胶体扭曲    需要在电泳时观察胶体，避免过度电泳后变形，但轻微的变形一般不影响条带的分析。制胶是否均匀以及胶液是否充分混匀、充分凝固等也直接影响电泳后条带的形状，上下层胶合适的高度、包括上层胶梳齿处的均匀度及加样量等亦有影响，如图8所示。

3    討论

WB技术发明至今已超40年，被广泛用于分子生物学、农业、医药等领域的研究。该技术作为一种将组织或细胞中的蛋白表达可视化的方法，为分子科技的进步和人类认知疾病等诸多方面作出了贡献。

除文中提到的技术因素引起的异常结果外，第一抗体的选择也是该技术的核心问题。目前市售有多种国内外厂家生产抗体，质量参差不齐，厂家会在说明书中标明抗体的序列，但购买者往往无法确切验证其质量。蛋白质在产生过程中经历可变剪接（alternative splicing）、翻译后修饰（post-translational modification）等改变，使得细胞或组织中的蛋白质存在多样性，可能会具有多种亚型（isoform），而抗体往往只针对某一基因保守区产生的蛋白而设计，使用单一抗体有可能会造成漏检。值得注意的是，使用单种抗体却得到多个条带结果的现象并不少见，由于目前主流观点是，使用符合预期分子量的单一条带对WB结果进行解释，这很可能会忽略了可能是其他亚型成分的“杂带”，最终可能会导致错误的结果解释，并导致WB结果与免疫组化染色实验结果的冲突[3]。有研究表明，某些癌细胞株中可能仅有不到1/10的基因只表达1种野生型蛋白，其余以其他多种亚型存在，这些亚型的分子大小与预期相差较大；在某些情况下，WB中仅有1/4～1/3的野生型蛋白按预期在SDS凝胶中迁移，而这些亚型则很可能是引起多个条带存在的关键因素[4-5]。因此，抗体的选择及其信息对于WB结果的解释十分重要。实验中所遇到的“杂带”也可能有重大意义，但受目前技术限制，无法确切得知蛋白具体表达的亚型情况，也难以得知“杂带”究竟是蛋白异构体的亚型引起或技术固有因素导致的蛋白迁移率异常。由于WB技术往往使用管家基因产生的蛋白作为内参，尚需要明确所选内参蛋白的表达是否会在某些特定情况下（如肿瘤、炎症等）受到影响。有学者认为需要使用多种抗体共同验证且对多个条带进行科学解释，并选择不同的内参共同进行参考[6]。这些技术因素、生物因素均可导致意外结果的出现。

随着如微流控蛋白印迹杂交[7]、液相质谱等[8]新技术的不断涌现，人们对蛋白质组学的认知将会不断更新，从而不断对WB技术进行改进并加深对其认识。在传统的WB中，至少需要2 d时间才能得到1轮结果，其操作步骤复杂，需要配制的试剂繁多，影响因素多，实验中一旦遇到问题，需要逐一排查。本研究对实验室传统WB法所遇到的异常结果及处理方法进行了总结，希望对其他实验者有所帮助。

参考文献

[1] TOWBIN H，STAEHELIN T，GORDON J.Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets：procedure and some applications[J].Proc Natl Acad Sci USA，1979，76（9）：4350-4354.

[2] BURNETTE W N."Western Blotting"：Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A[J].Anal Biochem，1981，112（2）：195-203.

[3] LIU X，WANG Y，YANG W，et al.Protein multiplicity can lead to misconduct in western blotting and misinterpretation of immunohistochemical staining results，creating much conflict-ing data[J].Prog Histochem Cytochem，2016，51（3/4）：51-58.

[4] YAN R，ZHANG J，ZELLMER L，et al.Probably less than one-tenth of the genes produce only the wild type protein without at least one additional protein isoform in some human cancer cell lines[J].Oncotarget，2017，8（47）：82714-82727.

[5] QU J，ZHANG J，ZELLMER L，et al.About three-fourths of mouse proteins unexpectedly appear at a low position of SDS-PAGE，often as additional isoforms，questioning whether all protein isoforms have been eliminated in gene-knockout cells or organisms[J].Protein Sci，2020，29（4）：978-990.

[6] GORR T A，VOGEL J.Western blotting revisited：critical perusal of underappreciated technical issues[J].Proteom Clin Appl，2015，9（3/4）：396-405.

[7] 辛晓磊，慕轩，王欣，等.微流控蛋白印迹杂交与传统Western blot对目的蛋白的检测效果比较[J].基础医学与临床，2017，37（10）：1378-1383.

[8] 易可可，谢洁，龚晓云，等.液相色谱-串联质谱应用研究进展[J].计量科学与技术，2021（2）：7-15.

（收稿日期：2023-07-11）