中药余甘子对猪腹泻病原菌体外抑制作用的研究

曹 冶,谢 晶,康润敏通信作者,于吉锋,吴学婧

1.四川省畜牧科学研究院,四川 成都 610066 2.动物遗传育种四川省重点实验室,四川 成都 610066

0 引言

猪腹泻病是养猪生产中常见的疾病,症状主要表现为腹泻、呕吐、食欲不振,严重的会出现脱水症状。猪腹泻病不仅有较高的发病率,且死亡率高。生猪一旦发生严重的腹泻,如果预防不当、治疗不及时,会严重影响养殖效益。

生猪出现腹泻疾病主要是生猪自身、病毒和细菌以及三者之间的混合感染引发。在生产实践中,猪腹泻病主要受以下几种细菌的影响:大肠杆菌、猪霍乱沙门氏菌以及这2种细菌混合感染。目前主要采用疫苗来预防,已经发病的猪通过抗生素来治疗,但长期使用抗生素会带来严重的副作用,且会让病菌产生耐药性,导致严重的后果[1-2]。因此,寻找新的药物替代抗生素,防治猪腹泻病成为广大畜牧工作者关注的重点。

我国的中药已有几千年的历史,其主要来源于天然药材及其加工品,包括植物药、动物药、矿物药及部分化学、生物制品类药物,具有温和、无副作用、不会对病菌产生耐药性的特点,用中药来治疗猪腹泻病,是生猪饲养业发展的大方向和迫切需求[3]。目前中药治疗猪腹泻病主要集中于传统中药的研究,而对于藏药研究较少,因此,本研究采用余甘子等藏药来探讨中药治疗猪腹泻病的作用,以期寻找到更加有效的办法来防治猪腹泻病,满足生猪饲养业发展的迫切需求。

1 材料与方法

1.1 材料

中药余甘子、诃子、螃蟹甲、多刺绿绒蒿购自西南中草药批发市场。参试细菌猪霍乱沙门氏菌、大肠杆菌(ETEC)为四川某猪场分离纯化而得。

1.2 中药制备方法

1.3 药物最低抑菌浓度(MIC)

1.3.1 药物贮存液制备

根据提取药物溶解性等特点确定其浓度,并在4 ℃环境下保存备用。

1.3.2 培养基

猪霍乱沙门氏菌、大肠杆菌(ETEC)使用水解酪蛋白(MH)肉汤,pH为7.2～7.4。

1.3.3 接种物的制备

用接种环挑活化的形态相似待检菌落3～5个,接种于4～5 mL的水解酪蛋白(MH)肉汤中,35 ℃孵育2～6 h。增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或MH肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准,含(1～2)×108CFU/mL。用MH肉汤将上述菌悬液进行1：100稀释后备用。在15 min内接种完配制好的接种物,并取1份接种物在非选择性琼脂平板上传代培养,以检查接种物纯度。

1.3.4 稀释抗菌药物的制备及菌液接种

取无菌试管(13 mm×100 mm)9支,排成一排,除第1管加入1.5 mL MH肉汤外,其余每管加入MH肉汤1 mL,在第1管加入抗菌药物原液0.5 mL混匀,然后吸取1 mL至第2管,混匀后再吸取1 mL至第3管,如此连续倍比稀释至第8管,并从第8管中吸取1 mL弃去,第9管为不含药物的生长对照。然后在每管内加入上述制备好的接种物各1 mL,使每管最终菌液浓度约为5×105CFU/mL。

1.3.5 孵育

将接种好的稀释管塞好塞子,置35 ℃普通空气孵箱中孵育20 h;嗜血杆菌和链球菌在普通空气孵箱中孵育24 h。

1.3.6 最低抑菌浓度(MIC)的测定

在读取和报告所测试菌株的最低抑菌浓度前,检查生长对照管的细菌生长情况是否良好,同时还要检查接种物的传代培养情况以确定其是否污染,质控菌株的最低抑菌浓度值是否处于质控范围。以肉眼观察,药物最低浓度管无细菌生长者,即为受试菌的最低抑菌浓度[4-5]。

1.4 其他药物与余甘子相互作用效果评价

采用分数抑菌浓度指数[6-7](fractional inhibitory concentration index,FICI)表示,即联合用药时该药物的分数MIC值除以单独用药时药物MIC值的商,表示为:FICI=联合时分数MIC/单独时MIC。

FICI<1为协同作用,FICI = 1为相加作用,1 2为拮抗作用。

2 结果

2.1 中药制备

取余甘子、诃子粉末各100 g,用滤纸包好后,放入索氏抽提器中,加入中性去离子水索氏提取4～6 h,提取物用蒸发皿蒸干水分,分别得到深棕色的余甘子水提取物10.5 g、诃子水提取物10 g。余甘子水提取收率为10.5%,诃子水提取收率为10%。

称取螃蟹甲、多刺绿绒蒿粉末各100 g,用滤纸包好后,放入索氏抽提器中,加入无水乙醇索氏提取6 h,提取物用旋转蒸发器蒸干溶剂,得到深棕色的螃蟹甲醇提取物11 g、暗绿色的多刺绿绒蒿醇提取物10 g,螃蟹甲醇提取物收率为11%,多刺绿绒蒿醇提取物收率为10%。

2.2 最低抑菌浓度

根据余甘子水提取物的溶解性等特点,将余甘子水提取物用水稀释至30.331 g/L,作为本次参试的药物贮存液。

选用猪腹泻病常见细菌猪霍乱沙门氏菌、大肠杆菌(ETEC)以及二者1：1的混合菌作为余甘子的抑菌试验待试菌,进行最低抑菌浓度试验。结果显示:余甘子对它们有强烈的抑菌能力,对猪霍乱沙门氏菌,大肠杆菌(ETEC)以及二者1：1的混合菌的最低抑菌浓度均为1.516 5 mg/mL,具体如表1所示。

表1 参试药物对猪腹泻病常见细菌的最低抑菌浓度 单位:mg/mL

2.3 其他中药对余甘子抑菌能力的协同作用

为了验证其他中药对余甘子抑菌能力的协同作用,根据它们的溶解性等特点,将诃子水提取物用水稀释至60.645 g/L,螃蟹甲醇提取物用5%吐温80水溶液稀释至52.391 g/L,多刺绿绒蒿醇提取物用5%吐温80水溶液稀释至57.411 g/L。将这些溶液作为本次参试的药物贮存液。选用猪腹泻病常见细菌猪霍乱沙门氏菌、大肠杆菌(ETEC)以及二者1：1的混合菌作为余甘子和其他协同中药的抑菌试验待试菌,进行最低抑菌浓度试验。

结果显示:当余甘子/诃子/多刺绿绒蒿按1：3：1混合时,对猪霍乱沙门氏菌的最低抑菌浓度为0.060 7/0.363 9/0.103 3 mg/mL;对大肠杆菌(ETEC)的最低抑菌浓度为0.242 6/1.455 5/0.413 3 mg/mL;对二者1：1的混合菌的最低抑菌浓度为0.121 3/0.727 7/0.206 7 mg/mL。

当余甘子/诃子/螃蟹甲按1：3：1混合时,对猪霍乱沙门氏菌的最低抑菌浓度为0.242 6/1.455 5/0.471 5 mg/mL;对大肠杆菌(ETEC)的最低抑菌浓度为0.242 6/1.455 5/0.471 5 mg/mL;对二者1：1的混合菌的最低抑菌浓度为0.121 3/0.727 7/0.235 8 mg/mL。

当余甘子/诃子/螃蟹甲按1：2：1混合时,对猪霍乱沙门氏菌的最低抑菌浓度为0.189 6/0.758 1/0.322 9 mg/mL;对大肠杆菌(ETEC)的最低抑菌浓度为0.379 1/1.516 1/0.645 8 mg/mL;对二者1：1的混合菌的最低抑菌浓度为0.379 1/1.516 1/0.645 8 mg/mL。

当余甘子/诃子按1：2混合时,对猪霍乱沙门氏菌的最低抑菌浓度为0.337 0/1.347 7 mg/mL;对大肠杆菌(ETEC)的最低抑菌浓度为0.674 0/2.695 3 mg/mL;对二者1：1的混合菌的最低抑菌浓度为0.337 0/1.347 7 mg/mL。

当余甘子/诃子按1：1混合时,对猪霍乱沙门氏菌的最低抑菌浓度为0.758 3/1.516 1 mg/mL;对大肠杆菌(ETEC)的最低抑菌浓度为1.516 5/3.032 2 mg/mL;对二者1：1的混合菌的最低抑菌浓度为3.033 1/6.064 5 mg/mL。

当余甘子/多刺绿绒蒿按2：1混合时,对猪霍乱沙门氏菌的最低抑菌浓度为1.348 0/1.148 1 mg/mL;对大肠杆菌(ETEC)的最低抑菌浓度为1.348 0/1.148 1 mg/mL;对二者1：1的混合菌的最低抑菌浓度为2.696 1/2.296 3 mg/mL。

当余甘子/多刺绿绒蒿按1：1混合时,对猪霍乱沙门氏菌的最低抑菌浓度为6.066 2/10.333 3 mg/mL;对大肠杆菌(ETEC)的最低抑菌浓度为3.033 1/5.166 7 mg/mL。具体如表1所示。

为考察这些药物对余甘子的相互作用,将这些数据进行抑菌分数浓度指数计算(见表2),结果发现:当余甘子/诃子/多刺绿绒蒿和余甘子/诃子/螃蟹甲按1：3：1混合时,余甘子的分数抑菌浓度指数均小于1,说明这种组合的药物对余甘子抑制猪腹泻病原菌有协同作用。

表2 其他中药与余甘子对猪腹泻病常见细菌的抑菌指数

当余甘子/诃子/多刺绿绒蒿按1：2：1混合时,余甘子对猪霍乱沙门氏菌的分数抑菌浓度指数小于1,对大肠杆菌(ETEC)和二者1：1混合菌的分数抑菌浓度指数等于1,说明这种组合的药物对余甘子抑制猪霍乱沙门氏菌有协同作用,对余甘子抑制大肠杆菌(ETEC)和二者1：1混合菌有相加作用。

当余甘子/诃子按1：2混合时,余甘子对猪霍乱沙门氏菌以及二者1：1混合菌的分数抑菌浓度指数小于1,对大肠杆菌(ETEC)的分数抑菌浓度指数大于1且小于2,说明此浓度组合下,诃子对余甘子抑制猪霍乱沙门氏菌以及二者1：1混合菌有协同作用,对余甘子抑制大肠杆菌(ETEC)无作用。

当余甘子/诃子按1：1混合时,余甘子对猪霍乱沙门氏菌的分数抑菌浓度指数等于1,对大肠杆菌(ETEC)和二者1：1混合菌的分数抑菌浓度指数大于1。说明该浓度组合下,诃子对余甘子抑制猪霍乱沙门氏菌有相加作用,对余甘子抑制大肠杆菌(ETEC)无作用,对二者1：1混合菌会产生拮抗作用。

当余甘子/多刺绿绒蒿按2：1和1：1混合时,余甘子对参试菌的分数抑菌浓度指数均大于1,特别是余甘子/多刺绿绒蒿按2：1混合时对1：1混合菌以及余甘子/多刺绿绒蒿按1：1混合对猪霍乱沙门氏菌和大肠杆菌(ETEC)的分数抑菌浓度指数均大于2。说明多刺绿绒蒿单独对余甘子抑制猪腹泻病常见细菌无作用甚至是拮抗作用。

综上所述,诃子、螃蟹甲、多刺绿绒蒿与余甘子的多种药物组合也有较强的抑菌作用,大部分能协同余甘子抑制猪腹泻病常见细菌。这些发现对中药防治猪腹泻病打下坚实基础。

3 讨论

余甘子为大戟科叶下珠属植物余甘子(PhyllanthusemblicaL.)的干燥成熟果实,具有清热凉血、消食健胃和生津止咳的功效。现有研究证实70%乙醇提取物有较强的抑菌作用,抑菌活性强弱为:嗜热脂肪芽孢杆菌>变形杆菌>金黄色葡萄球菌>大肠杆菌>枯草芽抱杆菌[8-9]。本次研究发现,其水提取物同样有较强的抑菌作用,其杀灭猪霍乱沙门氏菌、大肠杆菌(ETEC)以及二者1：1混合菌的活性相当。

诃子具有广泛的抗微生物活性,对常见的人体致病菌均有抑制作用,对革兰阳性菌和革兰阴性菌都有高度敏感性[10-11]。螃蟹甲为唇形科糙苏属植物螃蟹甲(PhlomisyounghusbandiiMukerjee)的干燥块根,螃蟹甲干燥块根水、乙醇提取物对耐亚胺培南铜绿假单胞菌具有明显抗菌作用[12],其他未见报道。多刺绿绒蒿(MeconopsishorridulaHook.f.etThoms.)是罂粟科高山植物之一,主要分布在喜马拉雅山脉地区,具有接骨、活血化瘀、止痛的作用,为治头创伤最有疗效的药物,藏医多用于治疗头伤、骨折、跌打损伤等[13-14],但对细菌的抑制能力未见报道。本次研究发现,余甘子的水提取物,螃蟹甲、多刺绿绒蒿乙醇提取物对猪腹泻病常见细菌有较强的抑制作用。

4 结论

余甘子与螃蟹甲、多刺绿绒蒿、诃子多种药物组合也有较强的抑菌作用,大多数能协同余甘子抑制猪腹泻病病常见细菌。而不同的浓度组合,导致的药物相互作用差距较大。余甘子/诃子/多刺绿绒蒿(1：3：1)和余甘子/诃子/多刺绿绒蒿(1：2：1),前者后两种药物能协同促进余甘子抑菌,而后者后2种药物对余甘子抑制大肠杆菌(ETEC)和二者1：1混合菌有相加作用。余甘子/诃子(1：2)和余甘子/诃子(1：1),前者诃子对余甘子抑制猪霍乱沙门氏菌和1：1混合菌有协同作用,而后者诃子仅对余甘子抑制猪霍乱沙门氏菌有相加作用。这可能是由于这些药物均对这些细菌有较强的抑制作用,而诃子/多刺绿绒蒿中的某些成分可能有助于提升余甘子的抑菌作用,其促进作用与药物浓度有相关关系。