新生儿高胆红素血症与UGT1A1基因突变的关系研究

冯芝 王程锋 贺权 豆鹏产

新生儿高胆红素血症又称新生儿黄疸，是新生儿期最常见的表现之一［1］。新生儿高胆红素血症又可以分为生理性黄疸和病理性黄疸［2］。一般来说，生理性黄疸情况良好，在足月婴儿出生后2～3 d 出现，4～5 d 达到高峰，5～7 d 消退，最长延迟2周，血清总胆红素最高不超过12.9 mg/dL，这种情况不需要特殊治疗；病理性黄疸发生在出生后24 h内，持续时间长，足月儿超过2 周，早产儿超过4 周，血清总胆红素值相对较高，超过12.9 mg/dL，血清共轭胆红素值超过2 mg/dL［3］。随着分子生物学的快速发展，目前对于新生儿高胆红素血症研究的重点转移到与胆红素代谢有关的酶的基因突变方面。有研究显示，二磷酸尿苷葡萄糖醛酸基转移酶（UDP-glucuronosyltransferase，UGT1A1）基因启动子和编码区的突变可导致UGT1A1酶活性降低或消失，从而阻碍游离胆红素的葡萄糖醛酸化，降低胆红素代谢，使血清游离胆红素水平升高，导致新生儿高胆红素血症的发生［4］。有专家认为，UGT1A1基因的突变与新生儿高胆红素血症有关［5］。本研究旨在分析新生儿高胆红素血症与UGT1A1基因突变的关系，以期为临床治疗新生儿高胆红素血症提供帮助，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2021 年1 月至2022 年1 月古蔺县人民医院收治的新生儿高胆红素血症患儿100 例为观察组，其中男80 例，女20 例；孕周为37～42 周，平均孕周为（39.6±2.2）周；出生体重为3 200～3 456 g，平均体重为（3 328.6±122.2）g，病程为1～6 d，平均病程（3.5±1.6）d；选择同期体检健康新生儿50 名为对照组，其中男38 名，女12 名；孕周为37～42 周，平均孕周为（39.1±2.2）周；出生体重为3 200～3 457 g，平均体重为（3 327.6±122.1）g。高胆红素血症符合《新生儿高胆红素血症诊断和治疗专家共识》［6］的诊断标准。观察组纳入标准：①均为胎龄≥37 周；②黄疸发生在出生后2 周内；③血清胆红素升高且以游离胆红素升高为主。观察组排除标准：①之前经过特殊治疗；②低体重、营养不良患儿；③先天性消化道畸形。患儿监护人已签署知情同意书，本研究经院医学伦理委员会审核、通过。

1.2 方法

观察组常规给予双面蓝光箱进行间断蓝光照射，同时给予苯巴比妥钠（上海信谊药厂有限公司）5 mg/kg·d 连续喂服。在必要情况下给予碱化尿液、人血白蛋白和丙种球蛋白静脉滴注。

1.3 检测方法

1.3.1 血样采集和DNA 提取

采集2 mL 静脉血，用乙二胺四乙酸二钠盐抗凝，用Invitrogen-血液DNA 提取试剂盒-赛默飞提取DNA 并保存在-20℃待检。

1.3.2 基因检测

聚合酶链反应（PCR）引物根据文献数据设计。引物序列，上游引物：5'-GTC ACG TGACAC AGT CAA AC-3'。下游引物：5'-GTC CCACTC CAA TAC ACA C-3'。扩增片段为启动子区域的TATA 盒和整个外显子1，片段长度为987 bp（引物序列由上海生物工程服务有限公司合成）。反应体系：25 μL 2xEs Taq MasterMix（染料），上游和下游引物各2 μL，模板DNA 200 ng，去离子水50 μL。反应过程如下：在LD-PCR1 荧光PCR 仪器上94℃预变性2 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环35 次，72℃再延伸2 min。2%琼脂糖凝胶电泳用于确定PCR 产物是否为扩增的目的基因片段。以100 bp LadderDNA Marker（康为世纪公司）作为片段大小参照物。每次取5 μL PCR 产物在120 V 下电泳30 min。用紫外凝胶显像系统对凝胶进行显像和成像。合格PCR 产物在1～2天内被送往华大基因技术有限公司进行基因检测。

1.4 统计学分析

应用SPSS 26.0 统计软件进行统计学分析，应用Shapiro-Wilk 进行正态性检验，对符合正态分布的计量资料以（）表示，采用t检验；计数资料以n（%）表示，采用χ2检验或Fisher 精确概率计算。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料比较

观察组的血清总胆红素显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两组一般资料比较［n（%），（）］Table 1 Comparison of general information between the two groups［n（%），（）］

表1 两组一般资料比较［n（%），（）］Table 1 Comparison of general information between the two groups［n（%），（）］

2.2 UGT1A1 基因检测结果

在UGT1A1基因启动子区共发现TATA 错义突变47 例，观察组35 例，对照组12 例，观察组的TATA（TA）6/7 错义突变基因分布、基因频率均高于对照组，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。在UGT1A1基因第1 外显子区共发现P229Q 错义突变8 例，其中观察组7 例，对照组1 例，观察组的P229Q（TA）6/7 错义突变基因分布、基因频率均高于对照组，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。在UGT1A1基因1 外显子区共发现G71R 错义突变33 例，其中观察组18 例，对照组15 例，观察组的G71R（TA）6/7 错义突变基因分布、基因频率均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表2 两组UGT1A1 TATA 基因型分布以及等位基因频率比较［n（%）］Table 2 Comparison of UGT1A1 TATA box genotype distribution and allele frequency between the two groups［n（%）］

表3 两组UGT1A1 P229Q 基因型分布以及等位基因频率比较［n（%）］Table 3 Comparison of UGT1A1 P229Q genotype distribution and allele frequency between the two groups［n（%）］

表4 两组UGT1A1 G71R 基因型分布以及等位基因频率比较［n（%）］Table 4 Comparison of UGT1A1 G71R genotype distribution and allele frequency between the two groups［n（%）］

2.3 影响新生儿高胆红素血症的多因素分析

多因素Logistic回归分析结果显示，G71R 错义突变是新生儿高胆红素血症的独立危险因素（OR=5.376，P＜0.05）。见表5、6。

表5 影响新生儿高胆红素血症的变量赋值Table 5 Assignment of variables affecting neonatal hyperbilirubinemia

表6 影响新生儿高胆红素血症的多因素Logistic 回归分析Table 6 Logistic regression analysis of multiple factors affecting neonatal hyperbilirubinemia

3 讨论

高胆红素血症是指胆红素代谢和排泄的正常途径发生改变，导致血清胆红素值超过正常范围，并导致皮肤、巩膜或其他器官呈黄色的病症，常见于早产儿［7］。由于新生儿的胆管尚未发育完全，无法及时排出游离胆红素，导致胆红素在体内过度积聚，进而引起黄疸。体外研究表明，胆红素是UGT1A1酶的结合底物，而UGT1A1酶是肝脏中参与胆红素代谢的唯一酶［8］。因此临床怀疑除了已知的黄疸原因外，不明原因的新生儿高胆红素血症的发生与UGT1A1基因的突变有关［9］。

全世界范围内距今已发现300 多种UGT1A1的突变类型，而胆红素病症的突变方式主要包括插入突变、错义突变、缺失突变三种［10］。本研究结果显示，观察组的G71R（TA）6/7 错义突变基因分布、基因频率均高于对照组，提示G71R（TA）6/7 突变基因和新生儿高胆红素血症有关。分析其原因在于，有机阴离子转运多肽（OATPs）是一组在G71R 生物膜上发现的转运蛋白，对生物体内各种内源性和外源性物质的摄取和清除非常重要［11］。而新生儿高胆红素血症的严重程度取决于G71R基因的不同突变对蛋白质功能的影响。突变的G71R基因的翻译产物因为其氨基酸序列与正常G71R 不同，从而失去了正常G71R 的功能，导致原有基因不能折叠产生正常G71R 的三维结构。而G71R（TA）6/7 错义突变引起了单氨基酸替换，导致原有蛋白质结构改变，从而影响蛋白质或酶的生物功能。本研究结果与Shibazaki等［12］的研究结果一致。

本研究进一步多因素Logistic回归分析结果显示，G71R 错义突变是新生儿高胆红素血症的独立危险因素。分析其原因在于，由于大脑的特殊结构，血脑屏障在很大程度上决定了大脑中的内源性物质的浓度［13］。G71R 是血脑屏障的一个重要转运体，影响着胆红素进入大脑的程度，G71R在原代脑微血管内皮细胞上的表达证实G71R 是一种重要的转运体，其作为一种转运体存在于肝脏中，参与胆红素的代谢［14］。肝细胞的基底膜含有许多转运体，促进胆盐、一些可溶性有机脂质底物的吸收，包括胆红素等内源性底物、药物和外源性物质。而人体的吸收主要靠Na+依赖性和非Na+依赖性转运体，G71R基因是一种非Na 依赖性转运体，对底物的亲和力很广，负责吸收未结合的胆盐、胆红素化合物、甲状腺激素、中性粒细胞、大量的药物和外源性物质，对体内胆红素的代谢有重大影响。本研究结果符合Walker-Pizarro等［15］的研究。

综上所述，新生儿高胆红素血症的发生和G71R 错义突变有关，UGT1A1G71R 错义突变可能是该病发生的危险因素，UGT1A1G71R 错义突变可能会提高新生儿高胆红素血症的发病几率，该项研究可为临床发生不明原因新生儿高胆红素血症提供检测依据。