结核病分子检测靶标研究进展

朱银银 张洪英★

分枝杆菌种类繁多，部分菌种感染人体后会造成健康威胁。根据临床致病，可将分枝杆菌分为如下几类［1］：一、导致结核病（tuberculosis，TB）的结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosiscomplex，MTBC）；二、导致麻风病（leprae）的麻风杆菌（Mycobacterium.leprae，M.leprae）；三、导致非结核分枝杆菌病（nontuberculous mycobacterial disease，NTMD）的非结核分枝杆菌（nontuberculousmycobacteria，NTM）。因为不同物种在流行病学、宿主谱和药物敏感性等方面存在差异，所以可靠地识别分枝杆菌感染对指导公共卫生决策至关重要。

TB 是世界流行性疾病，主要由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染造成，牛型结核分枝杆菌（Mycobacterium.Bovis，M.bovis）和卡介苗（Bacillus Calmette Guerin，BCG）感染也较多见，偶见MTBC 中其他分枝杆菌的感染［2］。

结核病的常规诊断方法为涂片法和培养法。涂片法使用广泛，但灵敏度和特异度较低。培养法培养周期长、易受实验环境限制且对技术人员要求高。分子鉴定作为传统鉴定方法的替代或补充，具有更灵敏、快速、简便的特点。核酸扩增实验（nucleic acid amplification tests，NAATs）是利用各种病原体的特异性基因片段以靶向检测与鉴定菌种的办法。

本文综述了已报道的分子检测靶标在以下几个方面的应用：一、检测MTBC；二、对MTBC 进行鉴定；三、确定MTBC 耐药性。

1 MTBC 检测靶标

在结核病诊断过程中，区分MTBC 和NTM 至关重要。常用插入序列IS6110、16SrRNA和hsp65基因区分MTBC 与NTM。

1.1 IS6110

插入序列（insertion sequence，IS）是可移动的遗传元件［3］，由两端反向重复序列和中间的转座酶编码序列组成，在不同的细菌和支原体中具有显著多样性，最早应用于分枝杆菌的诊断与鉴定。

IS6110仅存在于MTBC 中，已成为区分MTBC 和其他分枝杆菌的重要工具［4］。基于临床分离株之间的IS6110拷贝数和染色体位置变异产生的多态性，为每一株MTBC 提供了独特DNA 图谱。IS6110限制性片段多态性分析（restriction fragment length polymorphism，RFLP）已被广泛用作结核病流行病学研究金标准［4］。但该方法对IS6110低于5 拷贝的菌株分型能力不够，并且手动RFLP 方法费时费力且技术要求高，这需要研究人员进一步开发新的检测试剂盒。相比于培养法和涂片法，IS6110实时PCR 在肺结核诊断中表现出高灵敏度和特异度［5］。液滴数字PCR（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）可以检测到血浆中存在的浓度很低的IS6110［6］，即使是无症状的结核接触者，也可以检出血浆中的结核DNA［7］。尽管ddPCR 被认为是定量MTB 的可靠且可重复的方法，但是样品质量和DNA 提取过程是主要的误差来源［8］。日本Eiken 公司基于IS6110生产的环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）检测试剂盒被世界卫生组织推荐应用于临床结核病检测，但该技术的灵敏度和特异度低于Xpert MTB/RIF 技术［9］。LAMP 检测结果取决于样本质量，这表示需要建立有效的标准化检测系统，以避免低质量的样本收集和核酸制备导致的结果偏差。IS6110在结核病NAATs 诊断中广泛应用，但值得注意的是，该IS在极少部分的菌株里存在缺失，这可能导致假阴性结果出现［10］，此时需要结合其他诊断方法综合判断。

1.2 16SrRNA

16SrRNA存于除病毒外的所有微生物中，被认为是鉴定所有细菌的金标准［11］。16SrRNA由保守区和高变区交错排列组成，保守区是所有细菌共有，高变区在不同细菌中具有特异性，因此可以根据菌种特异性设计引物。利用16SrRNA基因的特异性引物，实时PCR 可以帮助区分MTBC 和NTM，能够达到较低检测限并区分活菌与死菌［12］。然而，仅对16SrRNA进行分析不足以准确区分MTBC 和NTM 菌种，因为MTBC 成员之间具有高度同源性，且一些NTM 之间具有相同的16SrRNA序列［13］。

1.3 HSP65 基因

热休克蛋白（Heat Shock Protein，HSP）保守存在于分枝杆菌中，也在分枝杆菌属不同菌种之间存在较大差异。使用HSP65PCR-RFLP 方法可以区分MTBC 和NTM，可为临床提供信息［14］。Kadasu等［15］通过HSP65基因测序发现了新型稀有的NTM。Wang等［16］使用HSP65基因测序成功区分NTM 与非分枝杆菌，同时确定了40 种NTM 菌株与MTB。然而，也有研究表明HSP65基因对NTM 的鉴别能力低于编码冷休克蛋白的danJ基因［17］。

2 MTBC 鉴别靶标

MTBC 成员之间的毒力、致病性和药物敏感性的差异导致疾病治疗多样性，显示出提供具有物种区分能力的标记物的重要性。mtp40基因、cyp141基因和mtss90基因片段有助于区分MTBC 成员。

2.1 mtp40 基因

mtp40基因（Mycobacterium tuberculosis protein 40，mtp40）是MTB 中特异性抗原的编码基因。有研究表明，mtp40和IS6110基因的多重LAMP 可在40 min 内检测出125fg MTB DNA，并且可以有效地将MTB 与MTBC 中的其他成员区分［18］。另外，有研究者发现mtp40与坎纳分枝杆菌有交叉［19］，这表明不能单一依靠mtp40基因进行结核病诊断。

2.2 cyp141 基因

细胞色素P450（Cytochrome P450，cyp）是MTB中的一种代谢蛋白。Darban等［20］将cyp141基因作为新的靶点检测从痰标本中分离出的MTB。Farzam等［21］的研究表明cyp141基因的PCR 检测（培养分离菌株为97.1%，临床痰标本为85.7%）比IS6110基因PCR 检测（培养分离株为95.1%，临床痰标本为42.9%）更为敏感，并且这两个靶基因的特异度相等（100%）。然而，在检出特异性方面，出现了相反的结果，Darban等［20］的研究表示该基因部分存在于M.bovis 和BCG 中；而Farzam等［21］使用的引物不会与M.bovis 发生结合。以上研究表明，关于cyp141基因对MTB 的检测特异性，需要研究者根据差异性核酸片段设计特异性引物以区别检测MTB 感染者或M.bovis 感染者和BCG 接种者。

2.3 mtss90 基因片段

有研究者使用在线数据库中微生物的完整基因组数据和生物信息学软件，鉴定了MTB 特异性序列90（Mycobacterium tuberculosisspecific sequence 90，mtss90）［19］。它在329 株分枝杆菌与IS6110、16SrRNA的诊断符合率为100%［19］。与mtp40相比，其不但能够区分MTB 与卡介苗感染者，还能区分MTB 与非洲分枝杆菌、坎纳分枝杆菌，除与微小分枝杆菌有交叉反应外，特异性良好［19］。有研究以RPA 技术为基础对mtss90进行扩增检测，该方法与临床诊断有96.43%的符合率［22］。关于mtss90的研究较少，仍需作进一步评价。

3 MTBC 耐药检测标靶

MTBC 耐药性的检测对结核病防控具有积极意义。MTBC 耐药检测标靶具有双重意义，既可以检测MTBC，又可以检测出耐药性。

3.1 rpoB 基因

rpoB基因（RNA polymerase B subunit，rpoB）突变导致近95%利福平（rifampicin，RIF）耐药菌株产生［23］。其在分枝杆菌属中具有多态性，可用于分枝杆菌检测与鉴定，与16SrRNA相比，可以更进一步区分NTM 间的菌种［24］。此外，rpoB基因还可以作为结核病患者RIF 耐药检测靶点。Xpert-MTB/RIF以rpoB基因为靶基因实现对MTBC DNA 及利福平耐药性的检测。关于Xpert-MTB/RIF 技术的meta分析显示灵敏度为79%，特异度为90%［25］。Xpert-MTB/RIF Ultra 相较于Xper MTB/RIF 技术，额外整合两个多拷贝的分子靶标（IS6110和IS1081）来检测结核菌［26］，提高了少菌型结核样本的灵敏度［27］。有研究发现部分RIF 耐药菌株没有发生在RIF 耐药突变区，并且即使有些菌株rpoB基因发生突变，但仍对RIF 敏感［28］，这提示仅使用Xpert MTB/RIF技术无法检测出所有RIF 耐药菌株。

3.2 katG 基因

katG基因（catalase-peroxidase）有助于激活异烟肼（isoniazid，INH）药物和产生抑制脂质与核酸生物合成酶的活性物质。50%～90%的INH 耐药结核菌株都是由katG基因的315 号密码子单一突变引起［29］。德国Hain 公司根据katG基因和rpoB基因生产的检测耐多药结核试剂盒（GenoType MTBDR plus），与表型药物敏感性实验相比，对RIF 耐药检测的敏感性和特异性为98.7%和88.9%，对INH 耐药检测的敏感性和特异性为82.1%和94.4%［30］。单一检测INH 耐药基因的方法有溶解曲线分析法［31］和PCR-RFLP［32］等。然而，少部分INH 耐药性的产生与其他基因突变有关［29］，单一检测方法无法全部检测出INH 耐药。

3.3 gyrA和gyrB 基因

DNA 解旋酶基因A（gyrase subunit A，gyrA）突变是导致氟喹诺酮类药物（fluoroquinolones，FQs）耐药发生的主要原因，部分是由gyrB突变引起［33］。此外，FQs 耐药的突变有可能发生在gyrA和gyrB的FQ 抗性决定区之外［34］。有研究表明，gyrBPCR-RFLP 方法用于诊断结核病并鉴定MTBC 中的MTBC 和M.bovis，但无法分辨MTB和非洲分枝杆菌［35］。

4 总结与展望

综上所述，绝对完美的分子诊断靶标未出现。在实际临床应用中，可以根据检测要求和仪器设备选择合适的靶标和检测方法。但多个靶标的联合应用会提高灵敏度和特异度，并对菌株的耐药性做出检测。技术的进步并非旨在取代传统检测，而是在疾病诊断中发挥重要的补充作用，特异性分子靶标和不断完善的实验技术相结合，构建快速、灵敏、准确且适宜经济水平低而疾病负担高地区的NATTs 技术对于结核病流行的控制具有重要意义。