噬菌体在细菌性疾病治疗中的研究进展

程晓薇，田 伟，李相安

（青岛农业大学海都学院，山东 莱阳 265200）

1929年，弗莱明对于青霉素的发现为细菌病的治疗带来了曙光。抗生素自发现以来，作为预防和治疗细菌疾病的药物以及饲料添加剂被广泛应用，但由于对抗生素的使用缺乏管制，药物大量滥用，致使大量细菌产生耐药性，并且伴随着其耐药谱的不断扩大，抗生素的治疗效果显著降低，同时出现多重耐药菌甚至超级细菌[1]。

目前，人们正在寻找新的替代抗生素的疗法，例如基因药物、中药添加剂、益生菌等[2-4]。近年来噬菌体作为能感染细菌的特定病毒被广泛研究，其广泛存在于自然界环境和生物体中，对维持自然界微生物的动态平衡起着重要作用。与抗生素相比，噬菌体制剂以不良反应小、不易产生抗药性、安全性高、无残留且成本低等优势而备受关注。近年来国内外学者陆续发表一些关于噬菌体治疗技术的研究成果，在农业、畜牧业、水产养殖业以及人类的疾病中均有较好的治疗效果。近日，美国食品药品监督管理局（FDA）和美国农业部有机认证（USDA）批准了噬菌体Phageguard-E作为对抗大肠杆菌O157食品加工助剂的公认安全级产品（GRAS）认证，为今后在噬菌体治疗细菌性疾病的研究中奠定了良好的基础。

1 噬菌体与家畜细菌性疾病

2013-2017年，华中农业大学动物疾病诊断中心对9961个猪场的47175份样本进行细菌分离，检测结果显示，每年均有上千份样本存在细菌感染，以副猪嗜血杆菌和链球菌检出率较高，同时发现大肠杆菌和沙门氏菌在近几年的检出率也是越来越高[5]。在牛场由巴氏杆菌、链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌及沙门氏菌等引起的运输热、乳房炎、腹泻等也成为影响养牛业发展的重要疾病。胡东方等[6]就山东各地70余个牛场117份奶样进行了实验室分离鉴定和药敏试验，结果表明，牛病常见致病菌的多重耐药现象较为普遍，仅有少数几种药物如头孢类及喹诺酮类药物能够发挥有效抗菌作用。可见，在家畜细菌病方面的治疗，还是缺乏相应的治疗手段。杜春林[7]对贵州省副猪嗜血杆菌的研究中发现，副猪嗜血杆菌慢性感染仔猪，可引起仔猪日增重、料肉比和采食量等生长性能评价指标显著降低。韩博等人[8]调查发现，致病性细菌是奶牛乳房炎发病的一个主要因素，而每年奶牛乳房炎给全球奶牛产业造成的经济损失达350亿美元，其中印度乳业每年损失6亿欧元，澳大利亚乳品行业每年因乳房炎影响乳品质量而产生的损失超过1.3亿美元。细菌病的发生严重制约着家畜养殖业的生产。

Wall S K等[9]人实验发现，给3～4周龄的仔猪接种肠炎型鼠伤寒沙门氏菌血清，通过灌胃给予5 mL 109pfu/mL的噬菌体后，与未给予噬菌体治疗的仔猪相比，在回肠、扁桃体、盲肠处的沙门菌量减少99%～99.9%。李陇平等人[10]利用噬菌体治疗由金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎疾病，通过乳头药浴试验观察，使用效价在105pfu/mL的噬菌体治疗后，奶牛乳区发病率和乳头发病率各降低了1.97%和3.33%，对预防奶牛乳房炎的发生有着显著作用。Smith H W针对由大肠杆菌引起的犊牛腹泻研发的噬菌体，通过口服饲喂出生6～12 h的犊牛，发现效价仅105pfu/mL的噬菌体便可有效降低由大肠杆菌引发的犊牛腹泻。使用102pfu/mL的噬菌体喷洒在未清洁的牛舍中就能达到很好的预防效果[11-12]。目前，噬菌体在控制家畜的细菌性疾病方面，由于家畜复杂的消化系统及免疫系统还有许多工作有待去研究和探索，但是在生物技术引领未来经济社会发展的今天，这些问题会逐一被解决。

2 噬菌体与家禽细菌性疾病

我国家禽行业饲养量、禽蛋产量和消费均居世界第一，禽肉产量仅次于美国[13]。但随着集约化养殖模式的推广，家禽传染病也日趋频发。细菌病继发病毒感染，严重制约着我国养禽业的发展。禽大肠杆菌病造成家禽败血症、肉芽肿、气囊炎、腹膜炎、输卵管炎等全身或局部感染；产气荚膜梭菌造成的禽坏死性肠炎，每年给全球养禽业造成约20亿美元的损失[14]；禽沙门氏菌在公共卫生影响方面也是显著的[15]。

美国Huff教授[16]研究发现，将0.1 mL含有6×105cfu/mL大肠杆菌培养物注射到7日龄雏鸡体内，死亡率为48%，使用剂量为108pfu/mL、104pfu/mL噬菌体干预治疗后，死亡率降低到7%和10%。实验证明使用一定剂量的噬菌体可以有效治疗细菌性疾病，替代抗生素的作用。Miller等[17]就噬菌体对产气荚膜梭菌引起的禽坏死性肠炎的治疗效果研究显示，噬菌体混合制剂INT-401（5株环境中分离的产气荚膜梭菌噬菌体混合）能使肉鸡坏死性肠炎发病死亡率降低92%，且效果优于产气荚膜梭菌类毒素疫苗。青岛农业大学任慧英等[18]分离得到的禽沙门氏菌噬菌体vB-SpuS-Spp4，对不同来源的29株鸡白痢沙门氏菌的裂解率为100%，对44株其他鸡源沙门氏菌的裂解率可达68.2%。vB-SpuS-Spp4作为一株烈性噬菌体，效价高、裂解普广，对鸡白痢沙门氏菌具有很好的治疗作用。与家畜相比，禽类的消化道较短，肌胃特有的物理消化方式可能使其体内的噬菌体活性不易受到影响，在应用方面更具优势。2013年2月，由美国Intralytix公司研发的针对沙门菌的噬菌体制SalmoFreshTM被美国FDA认定为公认GRAS产品，并获批准上市，为噬菌体在中国的研发奠定了基础。

3 噬菌体与水产细菌疾病

随着社会的发展，人们生活水平不断提高，饮食需求也逐渐向多样化、多元化方向发展。水产品凭借其优质的蛋白与丰富的矿物元素等优点备受人类的青睐。人类在享受社会发展带来的利益的同时，又不断担心着食品安全造成的未知后果。近年来，我国水产养殖业迅速发展，但与此同时带来的水质污染，严重影响着水产动物的健康。因此，疾病控制应与水质净化紧密联系在一起。单纯使用药物进行疾病的控制，一方面会造成水质污染以及耐药细菌的产生，另一方面也耗费大量药品和人工，施药不均还会影响了动物的生长和繁殖，在经济上给渔业造成损失。噬菌体广泛存在于自然界及生物体内，利用噬菌体治疗技术，不仅可以起到治疗疾病的作用，也可以起到对水质的改善，不失为一种两全其美的办法。

副溶血弧菌广泛存在于海水，易富集在贝类体内，是已被证实的导致包括鲍、文蛤及牡蛎在内的多种贝类患病或死亡的病原菌[19]。胡蝶等[20]通过制备副溶血弧菌噬菌体微胶囊，发现试验组比对照组减少了96%的细菌，且在水体中的宿主菌也减少了72%。哈维氏弧菌是一种可引起对虾发光病及鱼类溃疡病的一种细菌，给水产养殖业造成了巨大的损失。Karunasagar等[21]利用噬菌体Viha10和Viha8治疗对虾发光病，通过注射噬菌体的对虾存活率分别为88%和86%，而注射氧四环素和卡那霉素的对虾存活率为68%和65%，显然该噬菌体治疗效果优于抗生素。Park等人[22]研究了单一噬菌体与噬菌体混合液在治疗香鱼变形假单胞菌方面的研究，研究结果显示，混合液造成的死亡率比单一噬菌体给药死亡率降低50%，证明在实际应用中，噬菌体鸡尾酒疗法无疑是一种较好的选择。

4 噬菌体在人类细菌疾病中的研究

在前期动物实验结果较满意的情况下，噬菌体治疗也逐渐向人类发展。在美国进行的安全性试验结果表明，将高浓度的噬菌体应用于人的鼻腔黏膜、口腔、皮下和静脉，在人体上试验了12年，最终发现只有轻微的副反应[23]。

科罗拉多大学Anschutz医学院研究人员在Nature Microbiology发表文章，揭示噬菌体与炎症性肠病（IBD）之间的关系。Breck Duerkop博士发现微生物菌群对维持肠道健康至关重要，这些生物组成的变化可能会引起机体炎症反应。炎症性肠病患者肠黏膜表面的噬菌体数量和丰度颇高，这表明噬菌体可能在IBD中起着某种未知的作用。后期他们希望采用噬菌体疗法来促进益生菌的生长，治疗炎症性肠炎[24]。

5 噬菌体在治疗细菌性疾病方面的优缺点

噬菌体是一类裂解杀灭细菌的生物因子，有严格的宿主特异性，相较于传统抗生素具有更高效和更专一的杀菌能力。它不会破坏宿主体内正常菌群，能够提高肠道有益菌的比例，且噬菌体杀菌后能够自然排出体外，不会造成药物残留，被人类认为是一种潜在的理想抗生素替代品。噬菌体广泛存在于自然界及生物体内，据估计地球噬菌体的数量高达1031个，易分离，治疗副作用较小，研发所需的时间短。通过一定工艺研究噬菌体与细菌的比例、最适培养基、发酵参数等，利用噬菌体发酵技术，约4 h，噬菌体便可增殖到107pfu/mL。所以，利用发酵技术生产噬菌体产品，成本低、耗时短，噬菌体效价高，已成为生产噬菌体的一种主要技术手段。

噬菌体在应用过程中产生抗性菌的突变频率明显低于抗生素产生抗性菌的突变频率。噬菌体的治疗效率较高，可在感染部位增殖，并且增殖很快，只需少量的噬菌体就可以完成大量杀灭细菌的工作，适用于人类医药、植物健康、动物健康、食品安全、饲料添加剂等领域。2006年FDA批准李斯特菌噬菌体鸡尾酒；2007年比利时布鲁塞尔批准噬菌体治疗；2014年欧盟签订用噬菌体治疗人类细菌感染跨国临床研究计划；2015年噬菌体纳入俄罗斯联邦国家药典十三版。目前市面上的产品有青岛诺安百特生产的诺安梭清，应用于产气荚膜梭菌的感染；浆炎清应用于鸭疫里默氏杆菌的感染；诺安弧克、诺安弧净系列应用于水产弧菌的感染；菲吉乐科公司已完成针对防治禽类饲养及屠宰加工过程中出现的细菌性感染的噬菌体制剂产品；针对猪饲养过程中的痢疾、子宫内膜炎等细菌性病害及环境消毒的噬菌体制剂产品；针对牛饲养过程中的乳房炎、子宫内膜炎及环境消毒的噬菌体制剂产品；针对南美白对虾早死综合症（EMS）的噬菌体制剂的研发。此外，动物健康、食品安全、环境治理以及农作物健康方向的产品正在研发。

噬菌体在治疗疾病时，也会产生一些不良因素。马晓丽等人[25]发现活性噬菌体的数量在注射入血后的数量随时间骤降，5 min后剩余约50%，15 min时已减少至不到20%。该研究组认为，血清中存在的某些免疫因子可能是导致噬菌体失活的主要因素，且很可能是由IgM介导的补体所引发；温和噬菌体不具有裂解细菌的作用，而是将其基因组整合到宿主菌的基因组上，有可能会使宿主菌获得毒力因子；噬菌体的药物动力学特征复杂，因而在给药的时间以及剂量方面不易把握；噬菌体本身携带毒力因子且裂解细菌时可能会产生内毒素等有害物质。

6 展望

任何事物都有两面性，在利大于弊的同时，如何避免减少不利因素的产生，是科研工作者一直追求的方向。针对其不利因素的产生，科研工作者已研究出一系列解决办法。针对噬菌体产生的毒素问题，可以先将其纯化，再用来治疗；选择烈性噬菌体用来治疗，采用噬菌体混合剂（鸡尾酒）疗法可拓宽其裂解谱，治疗效果更好；利用分子生物学技术或基因工程表达或改造噬菌体，使其具有更好的噬菌能力。

随着生物技术的不断创新，相信会有更多更好的噬菌体被研发出来用来治疗细菌疾病。面对细菌耐药形势的日益严峻，高效、安全、低残留的抗生素替代品—噬菌体制剂将会走向未来兽药市场。