人腺病毒疫苗研究进展

王 艳 谭丙绣 侯 喆 贾雷立 李利忠 赵 瑾

1.安徽医科大学公共卫生学院，安徽合肥 230032；2.中国医科大学公共卫生学院，辽宁沈阳 110122；3.解放军疾病预防控制中心生物安全科，北京 100071；4.解放军总医院京北医疗区红山口门诊部，北京 100191

人腺病毒（human adenoviruses，HAdVs）于1953 年在人腺样组织中分离出来，随后发现HAdVs是导致美国人群呼吸道感染的主要病原体，至此HAdVs 引起学者广泛关注[1]。截至2022 年3 月已确定了HAdVs 的111 种型别，分属7 个不同的亚属（A～G）。HAdVs 属于腺病毒科、哺乳动物腺病毒属，外部蛋白外壳呈规则的二十面体结构，主要由240 个六邻体、12 个五邻体基底和12 个从五邻体处垂直延伸的纤维蛋白组成。腺病毒可造成全身感染，近年来暴发愈发频繁，而且不同型别有不同的组织嗜性和临床表现，不同时间和地区优势型别也有所差异，并仍以重组的方式进化，从而导致组织嗜性改变，形成高致病力、高传染性的新型毒株，这给全球公共卫生事业带来极大的挑战。针对其暴发流行，目前无特效抗病毒药物，疫苗是降低感染最有效的措施。流行病学调查显示，人4 型腺病毒（human adenovirus type 4，HAdV-4）和 人7 型腺病毒（human adenovirus type 7，HAdV-7）是呼吸道疾病暴发的常见原因[2]，因此主要的疫苗研究方向集中在这两种型别。

1 灭活疫苗

最早的HAdVs 疫苗诞生于美国，是一种用福尔马林杀死的二价4 型和7 型疫苗，从受感染的猴子肾组织培养中制备而成[3]。沃尔特里德陆军研究所选择12 名志愿者，每人上臂三头肌注射1 ml该灭活疫苗，比较免疫前后血清中和抗体滴度。结果显示志愿者对4 型、7 型和3 型产生的中和抗体数量都有所增加，滴度增加与自然感染疾病后基本相同，但重复注射并未优于一次注射。随后对疫苗的有效性进行评估，将624 名新兵进行随机分组，A 组肌内注射1 ml 疫苗，B 组为对照组，接受安慰剂，1 周后进行第二次注射，进行为期8 周的观察。第1 周A 组和对照组呼吸道疾病发病率无明显区别，到第2 周至第5 周，A 组接种者呼吸道疾病预期发病率减少了87%，之后两组发病率相同。此试验也发现接种者对3 型抗体滴度与4 型和7 型病毒的一样高，也就是接种者不仅产生了4型和7 型病毒中和抗体，对3 型病毒也产生了一定的交叉保护[4]。然而，由于批次间变异、猿猴空泡病毒40（simian vacuolating virus 40，SV40）的污染以及3 型和7 型致癌性，该疫苗在1963 年被停用。

2 减毒口服活疫苗

20 世纪60 年代，美国国防部和美国国立卫生研究院与惠氏实验室合作生产针对4 型和7 型的口服、肠道活疫苗片。在1971—1996 年在军事基础训练中心得到广泛使用[5-6]。1996 年，惠氏停止生产该疫苗。随后几年腺病毒暴发水平恢复到疫苗前。2001 年由Barr 实验室用惠氏生产技术继续研究口服疫苗。2004 年对该口服疫苗进行随机、双盲、安慰剂对照试验，以评估其安全性和免疫原性。30 名志愿者口服疫苗，28 名志愿者接受安慰剂药物，随后观察8 周。第28 天4 型和7 型血清转化率分别是73%和63%[6]。试验证明该疫苗是安全的，且在研究人群中诱导了良好的免疫反应。一项针对4040 名新兵的第3 期多中心随机双盲安慰剂对照研究中，疫苗（两种肠溶片剂）效力为99.3%。4 型和7 型疫苗接受者的血清转换率分别为94.5%和93.8%，结果表明该疫苗耐受性良好，且安全有效[7]。2011 年3 月新型口服4 型和7 型腺病毒活疫苗获得美国食品和药品管理局的许可，重新实施普遍对新兵接种[8]。2020 年，沃尔特里德陆军研究所针对口服4 型和7 型疫苗的受试者6 年内收集的血清样本进行了评估，没有受试者表现出针对病毒的中和抗体滴度减弱，甚至有些受试者在接种疫苗后4 型和7 型的抗体滴度增加了4 倍，证明口服4 型和7 型活疫苗可以诱导长期免疫[9]。

3 重组HAdVs疫苗

2012 年，广州医科大学的研究团队构建了3 型和7 型的二价候选疫苗rAdMHE3[10]。2018 年该团队[11]在rAdMHE3 的E3 区表达55 型的六邻体蛋白，构建了重组三价人腺病毒疫苗（rAdMHE3-h55）。体外中和测定的结果表明，rAdMHE3-h55 可以诱导小鼠产生针对3、7 和55 型的中和抗体。此外，与未接种疫苗的小鼠相比，该疫苗的免疫完全保护了受3、7 或55 型攻击的小鼠，显示出较低的肺病毒载量和较少的肺部病理变化。同时，他们分别将7 型、14 型、55 型的六邻体与3 型的进行替换，得到四种重组体rAd3EGFP、rAd3H7、rAd3H14 和rAd3H55。采用β-丙内酯灭活技术将重组体等量浓度混合rAdMix，诱导小鼠对3、7、14 和55 型的平衡高滴度的中和抗体反应，与野生型诱导的抗体滴度相差不大，并且没有相互的免疫干扰，由此证明rAdMix 是一种针对3、7、14 和55 型新型四价候选疫苗[12]。2018 年，李潇[13]在HAdV-3载体六邻体蛋白的高变5 区中，插入了7 型六邻体主要中和抗原表位，构建了rAdMH5 重组体。在其基础上，将55 型完整六邻体插入rAdMH5 的E3区构建了rAdMH5-h55 三价重组体。该重组体表面组合了3、7、55 型的六邻体蛋白，在小鼠体内诱导产生这三种腺病毒中和抗体，同时攻毒实验显示rAdMH5-h55 免疫小鼠，其肺内病毒滴度低，病理变化轻。该结果表明，rAdMH5-h55 是良好的三价疫苗候选。

研究表明HAdVs 中E1 基因与肿瘤基因有关，该区域缺失会降低或者消除致癌性[14]。2018 年，Tian 等[12]研究构建了缺失E1 基因的复制缺陷型人3 型腺病毒。HEp-2/E1 可以补充E1 缺失突变体的功能。将人3 型腺病毒（human adenovirus type 3，HAdV-3）的部分基因组克隆到pPolyII 载体中，成为骨架质粒；同时构建了携带eGFP 基因的穿梭载体。将质粒和穿梭载体分别共转染HEp-2/E1 和293 细胞系，转染2 周后HEp-2/E1细胞出现典型的细胞病变效应（cytopathic effect，CPE），而293 细胞未出现；野生型HAdV-3 被重组HAdV-3 免疫小鼠的血清中和。实验结果表明，重组腺病毒3 型有可能作为HAdV-3 疫苗的候选疫苗。

研究表明E3 基因与宿主免疫系统相互作用有关，对病毒组装、复制和感染并不是必需的，因此作为载体时可删除E3 基因可增加外源基因插入[15]。2021 年，Guo 等[16]研究构建了两种E3 缺失的重组腺病毒ΔE3-HAdV4 和ΔE3-HAdV7，E3 基因缺失后病毒致病力和复制效率降低。此外，该二价减毒活疫苗单次免疫分别保护小鼠免受野生型HAdVs-4 和HAdVs-7 的攻击。与对照组相比，接种疫苗的小鼠的肺部病毒载量显著降低，肺部病理减少，证明了ΔE3-rAdVs 作为腺病毒减毒活疫苗的潜力，并为腺病毒疫苗的开发提供了一种新的策略。

4 核酸疫苗和基因工程疫苗

与传统疫苗相比，新型疫苗的安全性和有效性等方面不断提升，发展潜力更大，必然替代传统的疫苗形式[17]。2018 年，Tian 等[18]研究发现大肠杆菌中表达的重组HAdV-11 纤维旋钮三聚体被证明在小鼠中诱导针对11、7、14 和55 型的中和抗体。2019 年，Bullard 等[19]开发了一种单周期HAdV-7病毒（single-cycle Adenovirus type 7 virus，scAd7），该病毒比复制缺陷病毒更具免疫原性，它保留了复制其gDNA 的能力，从而增加了HAdV-7 蛋白的表达，大大提高了这种疫苗的安全性，使其成为预防HAdV-7 感染引起的呼吸系统疾病的理想候选者。2020 年，Lu 等[20]从HAdV-7 感染患者的外周血单核细胞中获得特异性人单克隆抗体（human monoclonal antibody，HMAb）。结果显示HMAb 3-3E仅与完整7 型六邻体蛋白或重组六邻体蛋白结合，与其他完整的病毒粒子未结合；HMAb 3-3E 在体外以低浓度有效中和HAdV-7；HMAb 3-3E 在小鼠模型中可免受HAdV-7 感染。因此，HMAb 3-3E有望成为HAdV-7 感染的安全有效的预防和治疗的手段。

5 流感减毒疫苗

2018 年，Gu 等[21]开发了一种冷适应减毒流感病毒，利用反向遗传学方法在冷适应流感疫苗神经氨酸酶基因主干中携带六邻体的表位。实验结果显示，免疫后的小鼠对流感和腺病毒有特异性、较强的抗体反应，且呈剂量依赖性。此外，有效的体液、黏膜和细胞免疫反应可以抵御野生型HAdV-3和HAdV-7 的攻击。研究表明该疫苗可作为一种潜在的抗腺病毒感染的候选疫苗，但有待进一步临床研究。

6 展望

近几年来，HAdVs 感染暴发愈发频繁，尤其以55型最为突出，其致病力和毒力明显高于其他型别[22]。腺病毒作为其他病毒疫苗载体而被熟知，但本身感染疾病并未得到太多关注。腺病毒种内和种间传播、不同宿主中的潜伏时间以及容易重组和逃避群体免疫的能力[23]，给疾病监测和防控带来极大的挑战。2011 年以来，美国军方一直使用针对4 和7 型的口服疫苗，美国新兵呼吸道感染急剧下降，但是还未向公众开放使用。我国一直在探索开发用于公众和军队的腺病毒疫苗[24]，研究方向集中于重组腺病毒疫苗，还在初步发展阶段；减毒疫苗针对腺病毒的减毒方法、质量控制等仍然有待探究；腺病毒不同型别感染细胞受体有所不同[25]，受体表达在人和动物体内有较大差异，因此疫苗研究中缺乏科学有效的动物模型进行有效性和稳定性评价。这些问题限制疫苗的研究，亟须解决。社会在关注腺病毒作为载体的同时，需要把关注点转移到腺病毒本身疫苗的研究中。