灵芝固态发酵中药渣产漆酶及其对偶氮染料的脱色

王锐丽,吴 燕,陈颐辉,陈 琼

(信阳农林学院 制药工程学院, 河南 信阳 464000)

0 引言

漆酶(Laccase,EC1.10.3.2)是一类含铜的多酚氧化酶,广泛存在于植物、细菌和真菌体内,白腐真菌是该酶的主要生产者,如毛木耳(AuriculariacorneaEhrenb)[1]、糙皮侧耳(Pleurotusostreatus)[2]、血红密孔菌(Pycnoporussanguineus)[3]、灵芝(Ganoderma)[4]、一色齿毛菌(Cerrenaunicolor)[5]等。漆酶能够氧化酚类、苯甲酸、芳香类和多芳香族碳氢化合物等多种底物,当O2作为电子受体时,可将分子O2还原为H2O,常被作为“绿色生物催化剂”用于土壤修复[6]、生物能源[7]、染料脱色[8]、生物检测[9]、纸浆废弃物处理[10]等方面。因此,筛选高产漆酶的菌株并优化发酵条件来提高酶产量或活性具有重要的现实意义。田嘉慧等[11]以玉米秸秆为底物,液态发酵,筛选出一株高产漆酶一色齿毛菌CerrenaunicolorGC.u01。LIU等[12]优化了云芝产漆酶的条件。郭良昊等[13]优化了Trametessp. LS-10C了发酵条件,提高了漆酶活力。

相比于液态发酵,真菌在固态基质上的生长更接近于其自然状态,选用廉价、易得的工农业副产物、废弃物和天然基质作为培养基进行固态发酵产漆酶已成为研究热点。YULIANA等[14]采用玉米芯和稻草作为基质培养灵芝产漆酶,提高酶活力。熊雪等[15]采用麦麸诱导香菇庆科R20分泌漆酶,提高了漆酶活力。近年来,伴随我国中药产业的迅猛发展,中药资源产业化过程中不可避免地产生了数千万吨的中药渣,中药渣富含纤维素、木质素类、蛋白类、矿物质以及一些微量元素等营养,将中药渣资源循环利用变“废”为“宝”,创造新的附加值是非常有必要的。目前研究主要集中在将中药渣应用于禽畜饲料生产、药用活性成分提取、燃料生产、育苗等方面[16-17],相比之下,应用于栽培食药用真菌以实现转化利用的相关研究还较为欠缺。

本研究以前期筛选到的真菌菌株SW2为研究对象,将中药渣作为该菌固态发酵的主要基质之一,优化培养条件提高漆酶酶活,探究所产漆酶对偶氮染料的脱色能力,为实现中药渣资源的综合利用和漆酶在染料脱色中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株与材料

菌株SW2由本实验室前期分离纯化,扩增ITS序列经测序、比对,鉴定为无柄灵芝Ganodermaresinaceum,其GenBank登录号为MH855781.1,该菌株保存于信阳市药用菌工程技术研究中心。

中药渣为河南羚锐制药股份有限公司生产“解毒散结胶囊”产生的部分药渣,主要成分为黄芩(ScutellariaeRadix)、丹参(SalviaemiltiorrhizaeRadix et Rhizoma)、连翘(ForsythiaeFructus)、茵陈(ArtemisiacapillarisThunb.)、虎杖(PolygonicuspidatiRhizoma et Radix)、陈皮(CitrireticulataePericarpium)等,湿物经干燥直至恒重,粉碎备用。

2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(2,2’-Azinobis(3-ethylbenzothiazoline -6-sulfonic Acid) Ammonium Salt,ABTS)(纯度≥98%)、愈创木酚(纯度≥98%)、亚甲基蓝(纯度≥90%)、酸性橙7(纯度>85%)、氨基黑10B(纯度≥98%)均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.2 主要仪器

Nanodrop one超微量紫外分光光度计,赛默飞世尔科技(中国)有限公司;XFH-75CA型电热式高压灭菌锅,浙江新丰医疗器械有限公司;Milli-Q Advantage A10超纯水系统,苏州赛恩斯仪器有限公司;Avanti JXN-26型高效离心机,贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司;GHA-300Y型全温摇床,杭州绿博仪器有限公司。

1.3 培养基

PDA培养基:马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂15 g,溶于1000 mL蒸馏水,pH自然。

种子液培养基:马铃薯200 g,葡萄糖20 g,蛋白胨5 g ,MgSO4·7H2O 1 g ,KH2PO42 g ,VB150 mg ,溶于1000 mL蒸馏水,pH自然。

固态发酵初始培养基:粒径为0.4 mm中药渣15 g,麦麸15 g,蒸馏水 45 mL,pH自然。

以上培养基于高压灭菌锅内121 ℃,灭菌30 min,备用。

1.4 实验方法

1.4.1 愈创木酚平板显色试验

采用愈创木酚平板显色法[4]初步验证菌株的产漆酶能力。将经活化处理过的SW2(直径大约5 mm)菌块转接到含体积分数0.05%愈创木酚的PDA培养基(G-PDA)中央,平板置于25 ℃恒温培养箱中,1 d后倒置培养,将置于PDA培养基上菌株作为对照组,观察菌落周边的显色圈状况。

1.4.2 粗酶液的制备

将活化菌块(大约5 mm3)转接到种子液培养基中,25 ℃、150 r/min培养5 d后,待液体培养基中有大量菌丝球出现,加入无菌玻璃球振荡1 d,将菌丝球充分打碎,制成均匀的种子液,再将种子液以10%的接种量转入到中药渣固态发酵培养基中,25 ℃培养14 d。待固态发酵结束后,取5 g固态发酵培养物将其剪碎,加入50 mL 0.2 mol/L的乙酸钠-乙酸缓冲液(pH3.8),置于25 ℃、120 r/min摇床上浸提4 h。再用4层纱布过滤,于10 000 r/min条件下离心15 min,所得上清液即为漆酶粗酶液。

1.4.3 漆酶活性的测定

3 mL反应体系中加入1 mmol/L ABTS 0.5 mL、0.2 mol/L的乙酸钠-乙酸缓冲液(pH3.8)2.4 mL 和100 μL适当稀释的酶液,混合均匀,置于28 ℃水浴锅中反应5 min后,冰浴终止反应,测定在420 nm (ε420=3.6×104L/(mol · cm))处的吸光度。用100 μL去离子水代替反应体系中的酶液作为对照组。一定的反应条件下,1 min内氧化1 μmol的ABTS所需要的酶量定义为1个酶活力单位(U)。

1.4.4 发酵条件的优化

1.4.4.1 单因素试验

在固态发酵初始培养基的基础上,以漆酶酶活为指标,进行单因素试验,分别考察原料比(7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7)、中药渣粒径(0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mm)、初始含水质量分数(50%、55%、60%、65%、70%、75%)、初始pH值(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5)、接种量质量分数(4%、6%、8%、10%、12%、14%)、碳源种类(葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉、糊精)及质量分数(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%)、氮源种类(蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、硫酸铵、硝酸钠、尿素)及质量分数(0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%)、金属离子种类(CuSO4、MgSO4、CaSO4、MnSO4、FeSO4、ZnSO4)及浓度(1、2、3、4、5、6 mmol/L)对灵芝固态发酵中药渣产漆酶的影响。

1.4.4.2 PB试验分析

选用N=12的Plackett-Burman(PB)试验设计考察原料比、中药渣粒径、初始含水质量分数、初始pH值、接种量、蔗糖浓度、酵母粉浓度、Mg2+浓度等8个因素对漆酶酶活力的影响,PB试验设计的因素和水平如表1,设3个虚拟项,筛选出对漆酶活性影响显著的主要因素。

表1 PB试验因素与水平设计Tab. 1 Factors and levels for PB design

1.4.4.3 正交试验优化

根据单因素试验和PB试验结果,选择发酵培养基中对漆酶酶活力影响最大的原料比、初始含水质量分数、接种量、酵母粉浓度等4个主要因素,设计正交试验因素与水平如表2。

表2 正交试验因素及水平Tab. 2 Factors and levels of orthogonal experiments

1.4.5 漆酶对偶氮染料的脱色

脱色反应体系总体积为5 mL,包括0.2 mol/L乙酸钠-乙酸缓冲液(pH4.0)4 mL ,200 mg/L经膜过滤偶氮染料(亚甲基蓝、酸性橙7、氨基黑10B)0.4 mL ,漆酶酶液(终浓度2 U/mL)0.5 mL和介体0.5 mmol/L ABTS 0.1 mL,于35 ℃条件下振荡反应,定时取样分别于染料最大吸收峰处(664、484、620 nm)测定吸光值。以添加等量灭活酶液的脱色体系作为对照组。按公式(1)计算染料脱色率。

(1)

式中:Ae为反应体系脱色后于染料最大吸收波长处的吸光值,Ac为对照组的吸光值。

1.4.6 数据统计分析

单因素试验方差分析及图表制作使用 IBM SPSS Statistics 26软件和Origin 22软件,采用Duncan法检验差异显著性,使用Design Expert 10软件对PB试验数据进行方差分析。

2 结果与讨论

2.1 菌株产漆酶能力的鉴定

由图1可知,相比在PDA平板上的生长情况,菌株在含0.05%愈创木酚的PDA(G-PDA)平板上生长稍慢,这可能是由愈创木酚的抑菌作用所致[20]。愈创木酚作为特征底物发生了氧化反应,菌落周边及底部形成了明显的棕红色显色圈,显色圈的直径大于菌丝延伸生长的范围,说明该菌株具有产漆酶能力。

图1 菌株在PDA(左)和G-PDA(右)平板上的生长情况Fig. 1 Growth performance of the strain on the PDA (left) and G-PDA (right) medium

2.2 单因素试验

2.2.1 原料比、中药渣粒径和初始含水质量分数对灵芝固态发酵产漆酶的影响

随着中药渣占比逐渐降低,漆酶酶活变化趋势如图2a)所示,当原料比为6∶4时,酶活达到(16.83±0.34) U/g。选用不同粒径的中药渣,其可作用表面积不同,同时原料之间的透气性也不同,决定着菌株在发酵过程有效利用原料的程度不同,进而直接影响着菌株的产漆酶能力。如图2b)所示,中药渣粒径为0.4 mm时,漆酶酶活最高,为(12.56±0.77) U/g。适宜的水分含量有利于营养物质的溶解,有助于透气和散热,对菌体生长和代谢都是至关重要的,由图2c)可知,随着初始含水质量分数的增加,漆酶酶活呈先增大后减小的趋势,当含水质量分数为65%时,漆酶酶活达到最大值(16.37±0.54) U/g。

注：不同小写字母表示菌体生物量显著性差异(P<0.05);不同大写字母表示黄酮产量显著性差异(P<0.05),下同。

2.2.2 初始pH和接种量对灵芝固态发酵产漆酶的影响

初始pH值对发酵产漆酶的影响如图3a)所示,pH值在4.0～6.5之间时,漆酶酶活为10.48～14.56 U/g。在偏酸性的环境下,pH对漆酶酶活的影响,差异性不是很显著。当初始pH值为5.5时,漆酶酶活为(14.56±0.22) U/g。适宜的接种量可缩短菌群生长的迟缓期进而缩短发酵周期,提升菌体发酵能力,如图3b)所示,在接种量在4%～12%区间时,漆酶酶活逐渐增大,且变化趋势很明显。当接种量为12%时,漆酶酶活达到(15.13±0.43) U/g,为最大值。继续增大接种量,漆酶酶活反而受到负影响,可能是因为在有限的营养物环境中,随着接种量的增大,菌株未能达到稳定期而提前衰亡。

图3 初始pH a)和接种量 b)对漆酶酶活的影响Fig. 3 Effects of initial pH a) and inoculation quantity b) on laccase activity

2.2.3 碳、氮源种类及添加浓度对灵芝固态发酵产漆酶的影响

基质中药渣和麦麸能提供部分碳氮源,在此基础上,筛选添加其他的碳源和氮源,考察其对菌株产漆酶的影响。如图4a)所示,在初始培养基中添加质量分数为1%的不同碳源,所得漆酶酶活有着明显的差异。当蔗糖作为碳源时,对产酶能力的影响明显高于其他5种碳源,漆酶酶活可达(18.56±0.22) U/g。随着蔗糖质量分数的增大,漆酶酶活呈先增大后降低的变化趋势。贾晨波等[18]在对端梗霉Z45产漆酶培养基进行优化时,确定了基础产酶培养基中蔗糖为最佳碳源。由图4b)可知,当蔗糖质量分数为2%时,漆酶酶活达到最大,为(21.39±0.48) U/g。在初始培养基中添加质量分数为0.5%的不同氮源,对漆酶酶活的影响如图4c)所示,相比于无机盐作为氮源,蛋白胨、牛肉膏、酵母粉这类有机氮更利于漆酶的积累,说明灵芝对成分丰富的天然有机营养物质的利用率明显高于其他,其中酵母粉的促进作用最佳,故选择酵母粉作为高产漆酶发酵培养基中的最佳碳源,与尚洁等[19]对一色齿毛菌产漆酶培养基的氮源筛选结果一致。由图4d)可知,当酵母粉质量分数为0.4%时,漆酶酶活达到最大,为(25.72±0.23) U/g。

图4 碳源种类 a)及质量分数 b)、氮源种类 c)及质量分数 d)对漆酶酶活的影响Fig. 4 Effects of carbon source type a) and concentration b), nitrogen source type c) and concentration d) on laccase activity

2.2.4 金属离子对灵芝固态发酵产漆酶的影响

将不同的1 mmol/L金属盐添加到初始培养基中,考察其对灵芝固态发酵产漆酶的影响。如图5a)所示,Cu2+和Mg2+的添加明显促进漆酶的产生,相对于未添加金属离子,漆酶酶活分别提高了23.64%和34.51%。漆酶是一类含铜的多酚氧化酶,大部分研究表明,培养基中适宜浓度的Cu2+是产漆酶良好的诱导剂,ZHOU等[20]通过Cu2+的添加能使P.ostreatusHAUCC 162胞外漆酶活性有所增加。Mg2+的促进作用也存在于刺芹侧耳发酵产漆酶过程中[21]。由图5b)可知,当Mg2+添加浓度为3 mmol/L时,漆酶酶活达到(17.69±0.12)U/g。而Fe2+的添加对产酶能力有抑制作用,对漆酶酶活的抑制率为25.45%,这与沈柯宇等[22]在考察重金属对灵芝漆酶活性的研究结果相似。Ca2+、Mn2+和Zn2+对漆酶酶活的影响不明显。

图5 金属离子种类 a)和浓度 b)对漆酶酶活的影响Fig. 5 Effects of metal ion type a) and concentration b) on laccase activity

2.3 PB试验结果

表3 PB试验设计及试验结果Tab. 3 Design of PB test and corresponding results

表4 PB试验显著因子分析Tab. 4 Analysis of significance of PB test

固态发酵培养基中的原料比(X1)、初始含水质量分数(X3)、酵母粉质量分数(X7)及接种量质量分数(X5)对灵芝固态发酵产漆酶的影响极显著(P<0.01),故把X1、X3、X5、X7等4个因素视为影响漆酶酶活的主要因素,进行正交试验优化。其余因素影响不显著,取单因素试验确定的最佳水平用于后续试验。

2.4 正交试验优化结果

灵芝利用初始培养基固态发酵所得漆酶酶活为(15.49±0.73) U/g,采用L9(34)设计正交试验,由表5可知,菌株产漆酶培养条件的最优组合为A2B1C2D3,即原料比(中药渣与麦麸比例)为6∶4,初始含水量质量分数为60%,接种量质量分数为12%,酵母粉质量分数为0.6%。在最优产漆酶条件进行3次平行验证试验,得到漆酶酶活为(56.13±1.20)U/g,是优化前的3.62倍,说明该组合条件适用于促进菌株高产漆酶。结合PB试验显著因子分析(表4)和正交试验极差分析(表5)的结果比较可知RD>RB>RC>RA,即酵母粉添加浓度对产漆酶能力的影响最大,其次是初始含水量和接种量,原料比的影响较小。

表5 正交试验结果与极差分析Tab. 5 Results of orthogonal experiment and range analysis

2.5 漆酶对染料的脱色作用

由图6可知,漆酶对3种偶氮染料的脱色率随时间的延长呈先增大而后逐渐平稳的趋势。对亚甲基蓝、酸性橙7和氨基黑10B的最大脱色率分别为 46.7%、84.6%和61.1%。对不同染料的脱色速度不同,亚甲基蓝在6 h即脱色完成,而酸性橙7和氨基黑10B达到最大脱色率需要9 h。

图6 脱色率随时间变化趋势Fig. 6 Change of decolorization rate of dyes with time

3 结束语

用中药渣和麦麸作为无柄灵芝固态发酵基质,经发酵条件的优化处理发酵14 d后,漆酶酶活为(56.13±1.20) U/g,表明该菌能利用中药渣这类废弃物实现资源的再利用和转化,但对其的利用率还有待进一步研究。此外,该菌所产漆酶在有介体ABTS存在时,对偶氮染料亚甲基蓝、酸性橙7和氨基黑10B均有脱色能力,为实现漆酶在染料脱色上的应用提供实验依据。本研究在脱色体系中添加的为未经纯化处理的粗酶液,对染料的脱色率相对较低。为进一步开发利用该菌漆酶,下一步将以漆酶的分离纯化、漆酶的固定化以及漆酶的异源高效表达等作为研究方向。由于工业生产排出的染料废水成分复杂,欲将该酶用于实际生产还需要更多的研究。