基于新型六方相硫化镉纳米材料的光电化学免疫传感器及前列腺特异性抗原灵敏检测

曹俊涛,高子惠,王玉玲,邵 晨,任书伟,刘彦明

(1. 信阳师范大学 化学化工学院, 河南 信阳 464000; 2. 信阳市中心医院, 河南 信阳 464099)

0 引言

前列腺癌是最常见的癌症,已经成为危害男性健康的重要疾病之一[1]。前列腺特异性抗原(PSA)是前列腺癌的早期诊断和筛查的最佳血清标志物,定期检测PSA将为降低前列腺癌死亡率提供有力保障[2]。因此,发展灵敏检测PSA的方法对临床诊断和预后评估都具有重要价值。目前,已报道的PSA检测方法有表面增强拉曼光谱法[3]、荧光免疫法[4]和电化学法[5]等。但是这些方法存在操作烦琐、背景信号干扰严重或仪器成本高等不足,开发背景信号低、操作简便的检测方法是很有必要的。

光电化学(photoelectro chemistry,PEC)生物传感器由于激发光源与检测信号的分离,背景信号干扰低,具有灵敏度高、背景信号低等优点[6]。PEC无标记免疫传感器是一种结合了PEC技术和无标签免疫分析法的生物检测方法[7]。该类传感器通过在电极界面上抗原和抗体之间的特异性结合,利用电极界面物理、化学性质的改变所引起的光电响应改变,实现目标蛋白的直接定量分析。检测过程无需标记,也无需反复离心、洗涤等,可有效避免标记过程以及多次分离步骤所导致的蛋白质失活等问题[8]。目前,PEC无标记免疫传感器已广泛应用于多种蛋白检测。例如,HE等[9]合成聚多巴胺薄膜和金纳米颗粒修饰的氧化锌纳米棒阵列,结合抗原-抗体间的特异性识别反应构建PEC无标记免疫传感器,实现对β淀粉样蛋白的定量分析。LI等[10]在硅纳米线阵列上原位涂上聚多巴胺,结合PEC无标记免疫传感器实现对心肌肌钙蛋白I的灵敏检测。QI等[11]将g-C3N4和PEC无标记传感方式结合,灵敏地检测J亚群禽白血病病毒。这些工作充分展示了PEC无标记免疫传感器简单、高效的检测优势。

光电活性材料对PEC传感器的分析性能具有举足轻重的影响。在各种光活性材料中,半导体纳米活性材料由于光电性能可调、比表面积大等优势在PEC传感器中应用广泛[12]。硫化镉(CdS)半导体纳米材料是一种在可见光区域有较强PEC响应的光活性材料,它的带隙较窄(约2.4 eV),有较长的电子寿命和较为显著的稳定性。材料的结构、形貌能够直接影响其性能,已有课题组报道了不同形貌的CdS材料具有不同的光电性能及光催化活性[13]。相较于普通CdS,六方相CdS由于直径变小,能带则变宽,光生电子向CdS表面的迁移速率增大,发生电子-空穴复合的概率降低,使光电流响应增强[14]。目前六方相CdS纳米材料在PEC生物分析领域应用较少,值得进一步探索。

基于此,本文通过将六方相CdS纳米材料与PEC无标记传感模式结合,提出了一种简单、高效的PEC免疫传感新方法。首先,将具有较高光电流响应的六方相CdS纳米材料修饰在氧化铟锡(ITO)电极界面,再通过层层修饰的方式,将PSA抗体、PSA抗原修饰其上,构建一种用于灵敏检测PSA的PEC免疫传感器(见图1)。由于不同含量的目标蛋白质PSA会产生不同程度的空间位阻效应,从而抑制检测底液中电子供体抗坏血酸(AA)向光活性材料CdS电极界面的转移,导致光电流强度发生不同程度的降低,进而实现对目标物PSA的灵敏检测。

图1 传感器的构建过程Fig. 1 The construction progress of the PEC biosensor

1 实验部分

1.1 药品和试剂

五水合氯化镉(CdCl2·5H2O)、壳聚糖(CS)购于阿拉丁试剂有限公司。九水合硫化钠(Na2S·9H2O)、抗坏血酸(AA)从中国国药化学试剂有限公司购入。铁氰化钾(K3[Fe(CN)6])与亚铁氰化钾(K4[Fe(CN)6])购于上海沪试实验室器材有限公司。戊二醛(GLD)购于上海西格玛奥德里奇贸易有限供公司。牛血清蛋白(BSA)、人免疫球蛋白(hIgG)以及人血清白蛋白(HSA)购于上海西宝生物科技有限公司。PSA(L2C001)标准液和PSA单克隆抗体(Ab1,L1C00401)购自上海领潮生物科技有限公司。所有化学试剂均为分析试剂级。光电流测试的检测底液为含有0.1 mol/L AA的0.01 mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH值为7.4)。电化学阻抗(EIS)是在含有0.1 mol/L KCl的5 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](1∶1)溶液中进行测试的。实验中,所有溶液的配制均使用实验室自制超纯水(超纯水机购于艾克有限公司)。

1.2 仪器

PEC系统是由PEAC 200A PEC的光源(功率为3 W的LED灯发射光谱范围为400～700 nm的白光,天津艾达恒晟科技发展有限公司)和CHI660E电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)组成。EIS数据由RST5200电化学工作站(郑州世瑞思仪器技术有限公司)获取,采用传统的三电极体系,以工作面积为0.25 cm2的ITO电极为工作电极,Ag/AgCl电极为参比电极,Pt线为辅助电极。利用Hitachi S-4800扫描电镜(SEM,日本东京)获得材料的形貌图像。X射线衍射(XRD)图谱是在Rigaku-Mini Flex 600型XRD分析仪(Cu Kα辐射,λ=1.540 6 Å,日本东京)上测定。

1.3 CdS的制备

CdS是根据先前报道的水热法进行制备[15]。首先,以pH值为1的去离子水为溶剂,CdCl2·5H2O为溶质,配制20 mL 54.8 mg/mL的CdCl2溶液,作为A液。以去离子水为溶剂,Na2S·9H2O为溶质,配制20 mL 96.1 mg/mL的Na2S溶液,作为B液。之后将B液逐滴加入A液中,搅拌至橙黄色。最后,将悬浮液转移至聚四氟乙烯高压反应釜中,在140 ℃条件下反应18 h后冷却到室温,利用去离子水和乙醇多次离心洗涤后收集沉淀,在60 ℃真空干燥箱中烘24 h得到橙黄色CdS粉末。

1.4 PEC免疫传感器的构建及测试过程

采用层层自组装的方式构建PEC免疫传感器(图1)。首先,将20 μL 2 mg/mL CdS悬浮液修饰在ITO电极表面,60 ℃烘干。为防止材料从电极界面脱落,也便于后续的修饰过程,将20 μL 0.1 mg/mL CS修饰于电极表面,60 ℃烘干。随后,在电极上修饰20 μL 5% GLD作为交联剂,再将20 μL 50 μg/mL Ab1滴在电极上,在37 ℃下反应1 h。将得到的电极界面与20 μL 1% BSA孵育,以抑制非特异性结合位点。最后,将20 μL不同浓度的PSA滴加在电极界面上,在37 ℃下孵育1 h,构建PEC免疫传感平台。在进行PEC检测时,将电极置于含有0.1 mol/L AA的PBS检测底液中。

2 结果与讨论

2.1 CdS材料的表征

光活性电极材料是构建高性能PEC传感器的关键,因此,对合成的光电纳米材料的形貌及晶体结构进行了表征。图2A为CdS的SEM图,可观察到CdS是由一种粒径在30～50 nm之间的颗粒堆叠而成。为了进一步证明材料的成功合成,对所制备的CdS材料进行XRD表征。如图2B所示,XRD谱线的半峰宽较小,其中,2θ=25°、26.5°、28°、44°、48°、52°、71°和72.5°的衍射峰分别对应(100)、(002)、(101)、(110)、(103)、(112)、(210)以及(211)晶面,和六方相CdS(JCPDS No.6-314)标准卡片一致,且没有发现其他衍射峰[15]。这些结果证明六方相CdS材料的成功制备。

图2 六方相CdS的SEM图(A)以及XRD表征图(B)Fig. 2 SEM image (A) and XRD pattern (B) of hexagonalphase CdS

2.2 免疫传感器的光电化学和电化学表征

为了证明传感器的成功构建,分别用PEC和EIS方法对层层修饰过程进行了表征。图3A为免疫传感器构建过程的PEC曲线。从图中可以看到,裸ITO电极没有光电流响应(曲线a);当修饰光电活性材料CdS之后,光电流信号明显增强(曲线b);在CS和GLD(曲线c)、Ab1(曲线d)、BSA(曲线e)以及PSA(曲线f)分别自组装后,光电流信号逐步降低,这可能是由于交联剂较弱的电荷转移能力以及蛋白质的空间位阻效应,阻碍检测底液中的电子供体AA到达光活性材料界面,从而降低传感界面的光电流响应。

图3 裸ITO电极和修饰后的电极光电流响应(A)及EIS谱图(B)Fig. 3 Photocurrent responses (A) and impedance spectra (B) of the bare ITO and the modified electrode

图3B是修饰过程中电极界面的EIS谱图,其半圆直径表示电荷转移电阻(Ret)。从图中可以看出,裸ITO电极(曲线a)的Ret较小,主要是因为未修饰的ITO电极具有较好的电子传导能力,而在电极表面修饰半导体CdS后(曲线b),CdS的弱导电性使得电极界面Ret值增加。当CS和GLD修饰在电极上(曲线c),桥连分子的电子阻碍作用进一步阻碍了电子转移,Ret增加。Ab1(曲线d)和BSA(曲线e)逐层修饰,Ret值也依次增加。最后,孵育了目标蛋白质PSA(曲线f)后,Ret继续增加,表明了特异性免疫反应的发生。由以上PEC和EIS数据可证实该免疫传感器成功构建。

2.3 条件优化

分别考察了修饰有不同浓度CdS悬浮液的传感器的光电流响应,对光电活性材料CdS的浓度进行了优化。从图4中可以观察到,随着CdS的浓度从0.5 mg/mL增加至2 mg/mL时,光电流响应迅速增大,这是因为更多的CdS可以提供更多的光生电子-空穴参与PEC过程;当CdS的浓度超过2 mg/mL时,光电流信号逐渐减小,这是由于CdS是半导体,导电能力差,过高的浓度会阻碍光生电子的转移。因此,采用浓度为2 mg/mL的CdS悬浮液用于传感器的构建。

图4 CdS浓度对光电流强度的影响Fig. 4 Photocurrent responses of CdS with different concentrations

2.4 免疫传感器的分析性能

以PSA为模型蛋白,在优化条件下,测试修饰了不同浓度PSA传感器的PEC响应。结果发现,随着PSA浓度的增大,传感器的光电流逐渐下降,这是由于在电极上固定的PSA越多,空间位阻效应越大,会更大程度阻碍电子的传递(图5A)。

图5 (A)不同浓度PSA的光电流响应;(B)光电流与PSA浓度关系和(内插图)免疫传感器的校准曲线Fig. 5 (A) Photocurrent responses of CdS/ITO modified by PSA with varied concentrations; (B) Relationship between photocurrent changes and PSA concentrations; the insert figure is calibration curve between photocurrents and logarithm of the PSA concentration

研究分析发现,当PSA浓度范围在1.0×10-12～1.0×10-7g/mL,光电流强度(I)和PSA浓度(CPSA)的对数之间存在线性关系(图5B),线性方程为I=-0.879lgCPSA+5.80,相关系数为0.996,检出限为5.0×10-13g/mL。

2.5 免疫传感器的选择性和稳定性

为了考察该传感器的选择性,选取了人血清中的HSA和hIgG为干扰蛋白进行选择性测试。从图6A可以看出,存在干扰蛋白HSA(4.0× 10-2g/mL)、hIgG(1.0×10-2g/mL)的光电流响应与空白对照组的信号强度非常接近。将1.0×10-9g/mL PSA与两种干扰蛋白混合进行测试,发现其信号强度与只修饰相同浓度PSA的传感器的信号强度基本一致。以上结果表明,该方法对于PSA的检测具有良好的选择性。同时,也对传感器的稳定性进行了测试。如图6B所示,将构建的传感器置于4 ℃的条件下保存7 d后,信号响应强度与新构建的传感器基本一致,表明该传感器具有较好的稳定性。

图6 免疫传感器的选择性(A)和稳定性(B)Fig. 6 Selectivity(A) and stability(B) of the immunoassay

2.6 实际应用

将该传感器用于实际样品人血清中PSA含量的测定,评估该方法的实际应用能力(表1、表2)。

表1 本文方法与参考方法测定人血清中PSA的含量Tab. 1 The concentrations of PSA in human serum samples using the method in this paper and the reference

表2 人血清标本中PSA的加标回收率Tab. 2 Recovery of PSA in human serum samples

以信阳市中心医院提供的7份人血清样本为研究对象,未经过任何的预处理。分析结果如表1所示,发现本文方法得到的结果和医院提供的参考值基本吻合,相对误差小于7.8%,相对标准偏差(RSDs)不大于7.0%,表明该方法具有满意的实际应用价值。除此之外,采用标准加入法对发展传感器的准确度进行进一步评估。如表2所示,加标回收率85.0%～111.6%,RSDs小于5.0%,表明该免疫传感器具有较好的准确度。

3 结论

制备了一种有较高光电响应的六方相CdS纳米材料,将其与PEC无标记传感模式相结合,发展了一种用于PSA灵敏检测的PEC免疫传感新方法。通过修饰在光电极上的抗体特异性识别PSA,形成免疫复合物,增大电极界面的空间位阻,抑制了电子供体AA向光活性材料界面CdS转移,使光电流强度降低,从而实现了对目标蛋白质PSA的灵敏检测。结果表明,所设计的无标记型PEC免疫传感器具有优异的灵敏度、良好的选择性和稳定性。所制备的六方相CdS纳米材料为开发简单高效的光电免疫传感器提供了新思路。