2022版新国标菌落总数测定法解读

朱应飞 康艳 聂翔 唐小叶 蔡玉霞 匡佩琳

GB 4789.2-2022《食品安全国家标准 食品微生物检验 菌落总数测定》是根据2016版标准修订完善而成的，虽然标明了相比2016版的主要变化，但具体操作细节并没有过多描述，检验人员在执行过程中容易出现问题。因此，本文将较全面地对GB 4789.2-2022的范围、设备和材料、培养基和试剂、检验程序、操作步骤、结果与报告等章节逐条进行分析和讨论，明确标准修订变化的依据以及可能存在的问题，并对食品检验机构正确应用该标准提出了技术性建议，以期进一步规范检验操作，减少实际工作中的不稳定因素。

一、范围

2022版标准的前言中，没有对适用“范围”进行修改。“本标准适用于食品中菌落总数的测定”，这一说法意味着标准仅适用于所有的食品，但一些含有较多抑菌成分的食品（洋葱粉、大蒜粉）、含较多防腐剂以及酸碱度异常等的样品，可能出现高稀释倍数培养皿细菌数与低稀释倍不成比例的情况，甚至成反比例关系。

二、术语和定义

2022版标准中菌落总数的定义表述欠准确，应改为：食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基成分、培养温度和时间、pH、需氧性等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落的总数。

三、设备和材料

本条中，2022版标准与2016版最大的区别在于将“恒温水浴箱”修改为“恒温装置”，扩大了保温方式的适用范围。在实际应用中，部分实验室在恒温水浴箱之外可能增加了专用培养基液化保温装置等设备，新版标准赋予了这些补充装置的合规性。新版标准还将温度范围由“46℃±1℃”改为“48℃±2℃”，增加了保温效果，避免了琼脂培养基容量较大时倾注过程中凝固较快的问题。

值得注意的是，2022版标准和2016版均未对无菌试管规格进行明确规定，后续的样品稀释环节需要使用规格为18mm×180mm的试管，有利于样品稀释液的混匀，在15mm×150mm甚至更小的试管中很难充分混匀，建议后续版本对此加以补充完善。

四、培养基和试剂

本条增加了“菌落总数测试纸片：应符合GB 4789.28中平板计数琼脂培养基质量控制要求”，但是质量控制时按PCA方法难以操作，纸片面积小，按标准需要接种16条线，线与线之间难以保持距离，容易发生重叠影响结果判断，并且冷凝胶形成胶体后较易破裂，质控时需要揭开表面的塑料膜并画线，冷凝胶很容易在操作之后破碎，影响后续结果，期待在修订GB 4789.28等标准时予以解决。同时，测试片中含有指示剂，应考虑参照GB 4789.28方法中的选择性分离和计数固体培养基的半定量测试方法进行培养基质控。

另外，本条中，2022版标准在“磷酸盐缓冲液”前面也加上了“无菌”二字，与无菌生理盐水表述一致，更加科学严谨。

五、检验程序

2022版标准将“选择2个-3个适宜稀释度”改为“选择1个-3个适宜稀释度”，与后续操作步骤中“样品的稀释”的改动一致。在“培养”和“计数各平板菌落数”之间增加了“36℃±1℃，48h±2h；水产品30℃±1℃，72h±3h”的文字描述，但却缺少测试片检验程序的相关描述。

六、操作步骤

1.样品的稀释。所有样品取样前应充分混匀后再进行取样，确保取样均一性。

（1）固体和半固体样品。①2022版和2016版标准均未对半固体作详细的定义，检验人员对此可能出现理解偏差，期待能够加以完善。标准要求“称取25g样品”，但在实际检验过程中不可能每个样品都能准确称量25g，GB 4789系列标准均未对称量范围有明确的规定。在这方面，美国农业部食品安全检查局的《微生物实验室指南》（Microbiology Laboratory Guidebook，MLG）中写到“重量和容量的波动范围±1%”，在该指南的沙门氏菌检验中又指出“除特别规定外，方法中所有指标的波动范围是±2%”。英国公共卫生署（PHE）公布的《National Infection Service Food Water and Environmental Microbiology Standard Method》中，样品的制备、稀释、倾注、培养章节中关于样品称样量均允许5%的偏差。因此，对于称量的偏差，实验室可以根据情况制定相应的操作规范。②2022版标准在磷酸盐缓冲液和生理盐水前都加了“无菌”二字，强调了无菌的重要性，体现了检验工作的规范性。③对于含有容易与细菌菌落混淆的细小颗粒的固体样品，建议使用带滤网的均质袋，均质后过滤可以达到较好的检验效果。④对于部分吸水性较强的样品，25g样品在225mL稀释液中不易充分溶解，建议采用扩大稀釋度的方式，取25g样品加入2475mL稀释液配制成1：100的稀释度溶液，然后进行检验。

（2）液体样品。2022版标准在本条中增加了三处内容：一是在磷酸盐缓冲液和生理盐水前增加了“无菌”二字，使标准表达更规范。二是增加了“或放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min-2min”，明确了液体样品允许使用均质器进行均质。三是增加了“当结果要求为每g样品中菌落总数时，按6.1.1操作”的描述，解决了粘稠度较高以及含有固体颗粒的液体样品不易按照体积取样的困扰。

（3）梯度稀释。2022版标准将“振摇试管或用1支无菌移液管反复吹打使其混合均匀”改为“在振荡器上振荡混匀”，明确并统一了样品稀释液的混匀方式，避免混匀不充分产生的结果偏差，同时有效防止有害气溶胶的形成，可以避免交叉污染。

（4）稀释度的选择。2022版标准将“2个-3个适宜稀释度”改为“1个-3个适宜稀释度”，更灵活，可选稀释度更广。允许只做1个梯度，对于检验污染率较低的样品而言，减少了检测的工作量，但对检验经验和操作水平要求更高，首先要评估样品的污染状况。而且仅有一个梯度时，可能出现菌落总数多不可计或平行不好的情况，难以保证检测结果的可靠性，因此建议尽量采用2-3个稀释度以规避可能的风险。另外，2022版标准还将所有“平皿”改为了“培养皿”，使表述更加规范。

（5）空白对照试验。在整个检验过程中，为了控制污染，需做空白对照实验。

（6）倾注培养基。①2022版标准将平板计数琼脂培养基冷却温度由“46℃±1℃”改为“46℃-50℃”，恒温水浴锅及其温度也分别改为“恒温装置”和“48℃±2℃”。2022版标准中规定的倾注温度与其他国家的标准存在细微差异，如美国FDA BAM规定PCA适合倾注的温度为45℃±1℃，ISO 4833-1：2013规定的温度为44℃-47℃（将改为47℃-50℃）。2022版标准中规定的倾注温度最高达50℃，有研究标明PCA冷却至50℃倾注，样品的菌落总数结果与冷却至45℃无显著差异，且50℃的PCA不易出现凝固现象，这为具体检验工作中培养基温度的控制提供了较宽的安全范围。②2016版标准提到的是“及时倾注培养皿”，但未明确规定多长时间完成，2022版标准中也仍未解决这一问题。食品样品大多营养物质比较丰富，当与磷酸盐缓冲液或生理盐水混合后会给微生物提供良好的生长环境。为了防止菌落数在此过程中发生显著变化，美国FDA BAM规定从样品原始稀释到倾注过程应在15min内完成。也有文献报道称，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min。因此，后续应对从样品前处理到琼脂倾注完成的时间给出明确规定。③将培养基用量“15mL-20mL”改为“12mL-20mL”，当培养基用量有所调整，培养基所含水分也相应变化，普通的恒温培养箱对湿度的控制比较差，当使用12mL培养基进行培养时，很容易出现干裂的情况，建议没有配备恒温恒湿培养装置的实验室仍然将培养基用量控制在15mL-20mL，且培养基厚度不低于3mm。

2.培养。（1）2022版标准在“待琼脂凝固后”前面增加了“水平放置”，强调了操作细节，并将2016版标准中的6.2.1和6.2.2的内容合并为6.2.1，还在6.2.2中增加了“如使用菌落总数测试片，应按照测试片所提供的相关技术规程操作”。（2）2022版标准仍未明确规定水产品的检测范围。不同于水产制品，水产品是指捕捞和养殖生产的鱼、虾、蟹、贝、藻类、海兽等带有原始菌相的产品，因此建议明确规定水产品的范围。（3）使用测试片检验时，测试片堆叠不宜过高，以免底部测试片被过度挤压而影响检验结果。

3.菌落计数。本条最主要的变化是删除了2016版标准中“每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数”这句话。然而，当同一个稀释度的两个平板仅有一个平板菌落数在30CFU-300CFU时，根据2022版标准规定，检验人员理解的该稀释度菌落总数有效结果应该是这一个平板的菌落数，但只计数一个平板的结果很显然存在一定实验误差，所有结果应该是两个平板的平均数，因此建议保留此处表述。

七、结果与报告

1.菌落总数的计算方式。2022版标准增加了附录B的示例，明確了菌落总数的计算方法。而对于所有稀释度的平板菌落数都不在30CFU-300CFU范围的情况，一些检验人员存在理解误区，选择以计算绝对差值的方式来判定哪个稀释度的平均菌落数更接近，但却忽略了一点，应将绝对差值乘以相应稀释倍数，换算到同一级别进行比较，因此建议在附录增加示例分析。

2.菌落总数的报告。2022版标准删除了2016版标准中的“若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延”，这对检验人员对于样品的预判和操作提出了更加严格的要求。2022版标准还规定，当菌落总数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。

综上所述，菌落总数检验从检验前的准备到最后的结果报告，每一步都要求检验人员细心严谨、精准操作，只有确保每个步骤都准确无误，整个检验才能更加可靠、准确，数据也才更有说服力。食品中的微生物检验至关重要，食品安全更是不容马虎，只有做好每一次检验，保证每一个数据准确，才能为食品安全保驾护航。