一步式QuEChERS结合液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱同时筛查与分析生牛乳中153种兽药残留

仝凯旋，常巧英，谢瑜杰，吴兴强，范春林，陈 辉

（中国检验检疫科学研究院，国家市场监管重点实验室（食品质量与安全），北京 100176）

在奶牛养殖过程中，兽药被用于保护牲畜免受真菌或疾病的侵害［1］。根据联合国粮农组织的数据，2018 年全球牲畜数量已达到312 亿头［2］。正确使用兽药可有效促进牲畜生长，但一些不法分子为追求利益，乱用和滥用药物使其在动物体内积累，对牛奶质量、工艺特性、乳制品质量有不良影响。而一些兽药具有热稳定性，很难通过热处理完全破坏［3］，其可通过牲畜转移到食物链中，人们长期食用含兽药残留的奶制品会对人体产生潜在毒性作用。为了保障消费者的合法权益，中华人民共和国农业农村部制定了畜产品中兽药残留的严格监管制度［4］。但兽药种类繁多，并且国家制定食品中兽药最大残留限量（MRL）越来越低，因此实现不同类别兽药高通量快速检测越来越富有挑战性［5］。

对于兽药多残留分析，液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）数据采集和数据开发技术的进步使其成为筛选各种小分子危害污染物的有力工具。目前已有多种筛查和定量方法被报道，包括使用液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（LC-Q TOF/MS）［2，6-7］和LC-Q Orbitrap/MS［1，8-9］。HRMS 使用高灵敏度的全扫描采集模式，加上高分辨率（＞50 000 FWHM）和高质量精度（＜5 ppm），使其在多类化合物分析和回顾性分析上具有独特的优势［10］。Sun等［1］基于LC-Q Orbitrap/MS 报道了一种集合数据依赖采集和数据独立采集的方法，将该方法分别应用于牛奶、番茄和玉米中农药、兽药、真菌毒素的快速测定，对比其他采集方法，该方法具有更高的重现性，并可以有效降低假阳性结果。在使用强大分析工具的同时，还要开发高效和广泛的前处理技术降低基质干扰和仪器的损耗，QuEChERS 方法应用范围广泛，可用于非极性到强极性目标化合物的样品制备。Desmarchelier 等［11］将QuEChERS 技术成功应用于动物原料中兽药多残留的验证，验证的105 种兽药假阴性率和假阳性率均低于5%。Zhang 等［12］报道了改进的QuEChERS 方法提取牛奶中90 种兽药，并将该方法应用于不同类型牛奶样品。一步式QuEChERS 方法可以通过全自动仪器快速完成样品前处理，且平行性好，Wang等［13］已将该方法应用于农药多残留筛查中。目前食品监测技术的趋势是将各类污染物组合到一个程序中，因此开发高分辨质谱同时筛查和定量多类兽药的检测方法具有重要意义。

本研究旨在建立一种改进的QuEChERS 前处理方法，对缓冲液、提取液、萃取盐和净化填料进行优化，并在此基础上使用一步式QuEChERS 前处理系统结合LC-Q Orbitrap/MS 实现生牛乳中15 类153种兽药的快速筛查与确证。对该方法的筛查限、定量下限、基质效应、回收率和精密度进行验证，结果令人满意，方法已成功应用于实际生牛乳样品的检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Ultimate 3000高效液相色谱-Q-Exactive静电场轨道阱高分辨质谱联用仪（美国Thermo Fisher公司）；Milli-Q 超纯水机（美国Millipore 公司）；N-EVAP112 氮吹浓缩仪（美国Organomation Associates 公司）；SR-2DS 型水平振荡器（日本TATEC 公司）；KDC-40 低速离心机（中国安徽中佳公司）；SiO-6512 QuEChERS自动样品制备系统（北京本立科技有限公司）。

153 种兽药标准物质（天津阿尔塔科技有限公司），纯度均大于95%，其中磺胺类兽药27 种，喹诺酮类25种，皮质类固醇类22种，咪唑类16种，受体激动剂类14种，杀虫剂类10种，大环内酯类7种，生物碱类5种，酰胺醇类5种，四环素类3种，丁酰苯类2种，吩噻嗪类2种，喹喔啉类1种，苯二氮卓类1 种，其他类兽药13 种；甲醇、乙腈、甲苯（色谱级，上海安谱实验科技有限公司）；甲酸、乙酸铵（质谱级，美国Honeywell公司）；C18、PSA、Z-sep（美国Agilent Technologies）。

1.2 标准溶液的配制

购买的标准品有粉末或标准溶液，固体标准品需称取适当质量，根据各类兽药的性质用不同溶剂超声溶解后配制成1 000 mg/L标准储备液，置于4 ℃冷藏避光保存。移取适量标准储备液用甲醇、乙腈或水稀释成10 mg/L的混合标准工作液，于4 ℃冷藏避光保存。

1.3 提取与净化

一步式QuEChERS 样品制备过程如下：称取样品2 g（精确至±0.01 g），置于整合套管中，加入6 mL Na2EDTA-McIlvaine 缓冲溶液、10 颗锆珠、10 mL 1%乙酸乙腈、4 g 无水硫酸钠、1 g 氯化钠，将含900 mg无水硫酸钠、30 mg PSA和90 mg C18的整合套管内管拧好后，按重量对称放入QuEChERS自动样品制备系统中，设置振荡转速4 000 r/min，离心转速4 500 r/min，时间300 s，重复2次。程序运行完毕后取内管2 mL 上清液于干净试管中，氮吹至近干，加入1 mL 乙腈-水溶液（50∶50，体积比）定容，超声混匀，经0.2 µm滤膜过滤后，待测。

1.4 液相色谱-质谱条件

Agilent Eclipse plus C18（3.0 mm×150 mm，1.8 µm，Agilent Technologies）色谱柱；柱温30 °C，进样量5 µL；流动相A 为0.1%甲酸水溶液；B 相为乙腈；梯度洗脱程序： 0 min：2% B；0～1.8 min：2%～15% B；1.8～3.5 min：15%～20% B；3.5～6 min：20%～25% B；6～7 min：25%～30% B；7～11 min：30%～35% B；11～13.5 min：35%～55% B；13.5～16 min：55%～85% B；16～20 min：85%～100% B；20～25.1 min：100%～2% B；25.1～28 min：2%～0% B；流速为0.5 mL/min。

正离子模式：喷雾电压：3 kV；毛细管温度：325 ℃；加热器温度：350 ℃；鞘气：40 arb；辅助气：10 arb；负离子模式：喷雾电压：-2.5 kV；毛细管温度：325 ℃；加热器温度：350 ℃；鞘气：40 arb；辅助气：10 arb。

扫描模式：Full MS/dd-MS2；扫描范围：m/z80～1 100；一级全扫描：分辨率70 000 FWHM，C-trap最大容量（AGC target）为1×106，C-trap最大注入时间为200 ms；数据依赖二级子离子扫描（dd-MS2）：分辨率：17 500 FWHM，C-trap 最大容量（AGC target）为2×105，C-trap 最大注入时间为100 ms；循环次数：5；归一化碰撞能量：20%、40%、60%；动态排除：8 s。153 种兽药的名称、保留时间（tR）、CAS号、加和离子形式、定量及定性离子精确质量数等信息见表1。

表1 生牛乳中153种兽药的质谱特性及验证结果Table 1MS characteristics and validation results of 153 veterinary drugs in raw milk

1.5 方法验证

使用TraceFinder 软件对样品的加合离子和二级碎片离子的精确质量和保留时间与自建精确质量数据库进行匹配，保留时间偏差介于±0.5 min，离子质量数偏差介于±5 ppm，需至少加合离子和1 个碎片离子检出，方满足定性筛查要求；使用基质匹配标准曲线外标法进行定量分析。根据EU/2021/808欧盟法规对筛查和定量方法进行验证［14］。对于筛查方法，可基于定性方法中的SDL 建立一定浓度水平上目标分析物的置信度，基本的验证应该包括对20个加标样品进行分析，其中至少95%的样品中检测到分析物的最低添加水平即为该分析物的筛查限（SDL）。定量下限（LOQ）是回收率和精密度均令人满意时的最小加标浓度。通过对空白基质做10 点标准曲线，涵盖所有化合物线性范围，最终选取5 点标准曲线以线性系数（r2）评估其线性关系。为评估方法的准确度和精密度，在1倍LOQ、2倍LOQ、10倍LOQ 3个加标水平下进行6组回收率实验。

2 结果与讨论

2.1 缓冲液pH值优化

油水分配系数（logP）是表征化合物溶解度的重要参数，是基于土壤吸附系数归一化到有机碳含量（logKoc）的模拟值［15］，logP值越小表明该化合物极性越强，水溶性越好，各类兽药化合物的logP值从Chemispider 网站查询（图1）。结果显示，超过90%的磺胺类和喹诺酮类兽药的logP＜2，因此考虑加入适量水提高各类兽药的提取效率。加入缓冲溶液不仅可以引入水体系，还可通过调节pH 值改变兽药的电离状态，影响其在有机相中的分配，因此缓冲溶液是更优的选择。Na2EDTA-McIlvaine作为缓冲溶液时可阻止四环素、喹诺酮类药物与金属离子的络合作用，从而提高兽药回收率［16］。本研究采用Na2EDTA-McIlvaine作为缓冲液，并优化了pH 值为4.0、7.0、9.0时的提取效率。如图2所示，缓冲液pH 4.0时目标兽药符合回收率（REC）要求的个数最多，其中吩噻嗪类药物中的异丙嗪、氯丙嗪，磺胺类药物中的酞磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶等，喹诺酮类药物中的沙拉沙星、司帕沙星等兽药在低pH 值下的回收率效果更好，而其他几类兽药的回收率受pH 值的影响不明显。方法的精密度在3 个pH 值下符合要求（RSD≤20%）的兽药个数相当，综合考虑选择pH 4.0为最优酸碱度。

图1 153种兽药化合物的logP值Fig.1 logP values of 153 veterinary drug compounds

图2 不同缓冲液pH值对兽药回收率及相对标准偏差（RSD）的影响Fig.2 Effects of different buffer pH values on recoveries and RSDs of veterinary drugs

2.2 萃取溶剂体积优化

由于前处理过程中需要同时萃取不同理化性质的兽药化合物，因此萃取溶液需具有通用性。Abdallah 等［17］对一系列兽药残留萃取溶剂进行萃取实验，发现乙腈对多类兽药的萃取效果最好，甲醇的萃取效果最差。在乙酸等改性剂的作用下，乙腈有良好的亲水亲脂性，同时还有沉淀蛋白的作用，不加入乙酸会提高样品中游离磺胺类药物的提取效率，但会导致喹诺酮类药物的回收率降低［18］。Zhang 等［12］研究发现萃取溶剂加入乙酸后会通过影响多类兽药的电离，从而影响萃取效率，且以乙腈中加入1%乙酸酸化后的萃取效果最好。因此，本研究使用1%乙酸酸化乙腈作为萃取溶剂，并对比不同萃取溶剂体积（10、16、20 mL）对兽药回收率的影响，结果发现溶剂体积为10 mL 时效果最佳，符合回收率要求的兽药占比为83.7%，高于其余两种溶剂体积（73.2%和76.5%），并且在50 µg/kg 的加标水平下，萃取溶剂体积降低会使单位体积兽药浓度增大，上机浓度随之增大，出峰峰形更佳，从绿色环保的角度最终选择10 mL的1%乙酸酸化乙腈作为最佳萃取溶剂。

2.3 缓冲盐种类优化

用乙腈萃取时可能会在水相和有机相之间产生二元相［19］，需加入萃取盐使两相分层并尽可能除去有机相中的水分。在最初的QuEChERS 方法中使用MgSO4和NaCl，但镁盐会诱导喹诺酮类药物的鳌合作用，因此采用Na2SO4代替MgSO4，同时对比了3 类常用萃取盐组合：传统QuEChERS组合（4 g Na2SO4+1 g NaCl），AOAC 组合（6 g Na2SO4+1.5 g 乙 酸 钠），EN 盐 组 合（4 g Na2SO4+1 g NaCl+1 g 柠檬酸三钠+0.5 g 柠檬酸二钠）的萃取效果（见图3）。结果显示，EN 盐组合对于各类兽药的回收效果最好，128 种兽药的回收率在70%～120%范围内，这是由于引入柠檬酸盐后进一步提高了缓冲作用。Desmarchelier 等［11］的研究也表明不加入柠檬酸盐的情况下，奶粉提取液中的乙腈相会形成凝胶，不利于下一步操作，实验最终选择EN盐组合作为萃取盐。

图3 不同萃取盐组合对兽药回收率及相对标准偏差的影响Fig.3 Effects of different extraction salting-out agents on recoveries and RSDs of veterinary drugs

2.4 净化填料优化

生牛乳是较为复杂的基质，含有大量脂质、蛋白质及其他干扰物质，因此在仪器分析前需进行净化，降低基质对仪器的损耗［20］。一些传统的吸附剂对各种基质的净化效果很明显，例如PSA 可有效去除有机酸和糖类，C18可去除脂类，Z-sep 是一种基于氧化锆基的新型吸附剂，可用于去除脂肪基质中的疏水化合物。本实验主要针对上述3种净化填料的组合进行优化。首先对Z-sep的量进行优化，比较了Z-sep 用量为0、15、30、60 mg时兽药的回收率（如图4）。结果显示，不使用Z-sep 作净化填料时兽药的回收效果最好，有131 种兽药回收率在70%～120%范围内，随着Z-sep 用量的逐渐增加，回收率合格的兽药数量逐渐减少，这是由于Z-sep 在吸附杂质的同时对部分兽药也有一定的吸附效果。对于不同取代基的目标化合物，Z-sep 吸附剂的亲和能力不同，取代基和吸附剂相互作用强弱可按如下排序：氯化物＜甲酸盐＜乙酸盐＜硫酸盐＜柠檬酸盐＜氟化物＜磷酸盐＜氢氧化物［21］。图5A 和B 分别为Zsep 使用量为0、30 mg 时马波沙星和沙拉沙星的提取离子流色谱图（EIC）图，结果显示随着Z-sep 的加入，两种兽药的响应强度明显降低。这是由于这两种喹诺酮类药物含有多个—F 和—OH 键，使得Z-sep 对此类药物的吸附性过强，导致回收率降低。随着Z-sep 用量的增加，马波沙星的回收率从82.7%降至23.4%，沙拉沙星从90.8%降至26.0%。为提高整体兽药的回收率，最终考虑不使用Z-sep作为净化填料。

图4 不同Z-sep用量对兽药回收率及相对标准偏差的影响Fig.4 Effects of different Z-sep dosages on the recoveries and RSDs of veterinary drugs

图5 未使用Z-sep（A）及使用30 mg Z-sep（B）时马波沙星和沙拉沙星的EIC图Fig.5 EIC diagrams of marbofloxacin and sarafloxacin without Z-sep（A） and with 30 mg Z-sep（B）

进一步优化不同PSA（0、30、60、90 mg）和C18（30、90、150、200 mg）用量对生牛乳的净化效果和兽药加标回收率情况（图6）。结果显示，PSA 为30 mg 时可使132 种兽药的回收率在70%～120%范围内，减少或增加PSA 用量均会降低兽药满意回收率的数量；回收率在70%～120%范围内的兽药数量则随C18用量的增加而增多，当C18为90 mg 时达到峰值。溶剂样品和提取后加标样品之间的响应差异被称为绝对基质效应。进一步考察方法的绝对基质效应，结果显示，生牛乳主要表现为基质抑制，不同PSA 用量中，30 mg PSA 的效果最佳，有73.6%的兽药基质效应在±20%以内；不同C18的用量中，90 mg C18效果最佳，有78.9%的兽药基质效应在±20%以内，回收率与基质效应规律一致，表明该净化填料组合的净化效果最优。因此，实验最终选用30 mg PSA 和90 mg C18用于后续实验。

图6 PSA（A）及C18（B）用量对兽药回收率及基质效应的影响Fig.6 PSA（A） and C18（B） amounts on recoveries and matrix effects of veterinary drugs

2.5 基质效应

基质效应（ME）是由共萃取物对目标化合物的电离作用引起，对于各类化合物基质效应的研究表明，基质抑制或增强常常伴随着分析方法的精密度显著下降［22］，如果不采取抵消措施，基质效应会影响方法的准确性。基质效应的评价公式为：- 1)×100%，当|ME|≤20%时表现为弱基质效应，20%＜|ME|≤50%时表现为中等基质效应，|ME|＞50%时表现为强基质效应［23］。本研究采用基质匹配标准曲线法进行基质效应评价，磺胺类、皮质类固醇类兽药主要表现为基质抑制效应，喹诺酮类则主要表现为基质增强效应。所考察的兽药中，84.8%的兽药表现为弱基质效应，10.5%的兽药表现为中等基质效应，其中主要包括磺胺二甲嘧啶、磺胺异唑等磺胺类药物，另有4.7%的兽药表现为强基质效应，表明本方法可有效降低基质效应的干扰，增强分析方法的精密度。

2.6 方法学验证

在优化条件下，按“1.5”考察生牛乳中153 种兽药的SDL 和LOQ。结果显示，153 种兽药的SDL在0.1～20 µg/kg 范围内，其中超过87.6%的兽药SDL 小于5 µg/kg；153 种兽药的LOQ 在0.1～20 µg/kg范围内，其中86.9%的兽药LOQ 小于5 µg/kg。Chen 等［24］结合LC-MS/MS 建立了SPE 方法测定生牛乳等基质中120种兽药残留，所有药物的LOD 和LOQ 分别为0.5～3.0 µg/kg和1.5～10.0 µg/kg；Deng等［25］使用LC-Q TOF/MS 建立了牛奶中105 种兽药的筛查和定量方法，其LOD 和LOQ 分别为0.01～5.96 µg/kg和0.04～18.45 µg/kg。本研究所建立的筛查和定量方法限量较低，有着令人满意的灵敏度，且全部化合物的灵敏度满足GB 31650-2019中奶类靶组织的最大残留限量要求（见表1）。

通过对生牛乳样品在0.1～200 µg/kg 范围内进行加标，利用基质匹配校准曲线方法计算线性关系，各化合物线性范围见表1，结果表明全部兽药的r2均在0.99 以上。以1 倍LOQ、2 倍LOQ 和10 倍LOQ的加标水平对生牛乳基质进行6 次重复验证，得到回收率和重复性结果，3 个加标水平下的回收率在70%～120%范围内兽药占比分别为92.8%、94.1%和94.8%，且RSD 均在20%以下，表明该方法有令人满意的准确度和精密度。

2.7 实际样品检测

为进一步验证该方法的实用性，使用最优方法对中国不同省份的32 批生牛乳真实样本进行检测，有12批次生乳样品检出孕酮，含量范围为10.5～21.3 µg/kg。

3 结 论

采用一步式QuEChERS 样品前处理技术结合LC-Q Orbitrap HRMS 建立了生牛乳中15 类153 种兽药的快速筛查与定量的高通量方法。该方法可在一个套管中完成样品的提取和净化，缩短了前处理时间，提高了样品前处理的平行性。对样品前处理条件进行优化，并在最优条件下对方法的筛查限、定量下限、回收率和相对标准偏差进行验证。本研究最大限度地减少了人工参与，方法简单直接，具有很强的实际应用价值。