QuEChERS/超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法筛查鲜桃中的农药残留

郭巧珍，杨 奕，刘丽萍，陈绍占，张 晶

（北京市疾病预防控制中心 食物中毒诊断溯源技术北京市重点实验室，北京 100013）

桃以其香甜的味道和丰富的营养成分成为世界上最受欢迎的水果之一。根据《2020 中国果品产业发展报告》统计数据，2019年我国的桃种植面积和产量均居世界第1位［1］。桃的果实成熟期主要在高温高湿的夏季，病虫害发生率极高。为保障果实品质和产量，农药的使用必不可少［2］。农药残留问题是桃类水果面临的主要挑战，也是国内外最受关注的食品安全问题之一。GB 2763-2021《食品中农药最大残留限量》［3］中规定了376种（类）食品中564种农药的限量，其中涉及桃的有178种。有针对性地开展农药残留风险监测是保障农产品安全的重要措施之一，为此，有必要了解桃中农药残留的实际状况。

目前，水果中农药的检测多集中于苹果、葡萄、芒果、草莓等水果［4-9］，对于桃中农药的检测报道较少，已有报道也多集中于单一类别农药的检测。程超等［4］研究了水果（包括桃）中有机磷的检测；Costa 等［10］比较了不同QuEChERS 盐析方法对罐头桃和新鲜桃中农药残留分析的影响；邓雅静［11］详细研究了桃中抗菌剂的膳食暴露风险；Li等［12］在我国不同产地的312 份桃中检出39 种农药，并对其进行了膳食风险评估，认为有9种杀虫剂为高风险农药；Dong 等［13］对桃中苯磺隆和苯甲环唑的残留水平进行了测定和暴露评估；李海飞等［14］采用QuEChERS 联合在线凝胶渗透色谱/气相色谱-质谱（GPC/GC-MS）测定了苹果、桃中的三唑类农药并对方法进行了评价；2021 年我国发布了GB23200.121《植物源性食品中331 种农药及其代谢物残留测定 液相色谱-质谱联用法》［15］。以上研究均采用单位分辨的气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）或液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法，为目前农药残留领域的主流分析方法［7，16-18］。

果蔬中通常存在农药多残留现象，因此农药高通量检测具有重要的实际意义。尽管目前已有很多基于GC-MS/MS 或LC-MS/MS 建立的农药多残留检测的标准方法或报道，但是由于食品基质的复杂性以及检测窗口和采集点数的限制，低分辨的质谱检测方法在开展超高通量检测时可能会存在假阳性或假阴性问题。以飞行时间质谱为代表的高分辨质谱（HRMS）分析技术具有超高的分辨能力和扫描速度，在多残留分析中具有更多的优势。Li等［19］基于GC-HRMS筛查了水果中的439种农药残留，殷雪琰等［20］基于气相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱法快速筛查和确证了农产品中的222种农药残留，毕军等［21］利用QuEChERS-冷冻诱导液液萃取/液相色谱-高分辨质谱法测定了蔬菜水果中的77 种农药残留，Wang等［22-23］利用四极杆静电场轨道阱类型的LC-HRMS 成功建立了水果中数百种农药的筛查方法。即便如此，与LC-MS/MS方法相比，液相色谱-高分辨质谱在水果农药残留检测中的实际应用仍然较少。

本研究采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱建立了鲜桃中农药的多残留筛查方法，并对23份鲜桃样本进行分析，以为水果中的农药残留监测和风险评估提供方法学借鉴和数据参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱仪（Acquity UPLC- Xevo ® G2-XS QTOF MS，美国Waters公司），电子天平（德国梅特勒公司），KS501IKA 旋涡混匀器（艾卡（广州）仪器设备有限公司），冷冻离心机（美国Beckman 公司），超声仪（昆山市超声仪器有限公司），Eppendorf 移液器（艾本德（上海）国际贸易有限公司）。Millipore-Elix-QE-QG 超纯水机（美国Millipore公司）。

LC-MS 级、色谱级乙腈（美国 J.T.Baker 公司），超纯水（Milli-Q Water System 纯化制备），乙酸（纯度大于98%，Acros Organics 公司），亮氨酸脑啡肽（LE，纯度＞96%，Sigma公司），无水醋酸钠和无水硫酸镁（百灵威公司），QuEChERS 填料（PSA、Carb 和无水硫酸镁，迪马公司）。农药类标准溶液（纯度均≥95%）购自天津阿尔塔公司。

1.2 样本信息

实验用鲜桃样品于2022 年5～7 月分别购买自北京、河北、江西、安徽、陕西、河南、江苏、山西、山东、湖南、浙江等地，共23份。

1.3 样本提取

将1 kg鲜桃清洗晾干后去除果核，取可食部分用多功能辅食机搅碎混匀。

称取鲜桃约5 g（精确至0.01 g）于50 mL 离心管中，加入5 mL 含有1%乙酸的乙腈溶液，再加入0.5 g 无水醋酸钠和2 g 无水硫酸镁，涡旋混匀，超声提取20 min，振荡后于4 ℃ 下9 000 r/min 离心10 min。取上层清液1 mL 加入分散固相萃取填料PSA 25 mg，石墨化炭黑（Carb）7.5 mg 和无水硫酸镁100 mg净化，旋涡后于4 ℃下10 000 r/min离心10 min，取上清液0.5 mL用UPLC-QTOF MS测定。

基质样品制备：称取5 g鲜桃样品（筛查结果中农药种类少且含量低的样品），每份样品按上述萃取过程进行处理，所得基质提取液用于配制标准溶液，质量浓度分别为0.5、1、5、10、50、100、500µg/L。

1.4 仪器分析

色谱条件：Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，粒径1.7 µm，美国Waters公司）。柱温：50 ℃ ，流速：0.45 mL/min，进样体积：5.0 µL，流动相 A 为含0.1%甲酸的乙腈，流动相 B 为含 0.1%甲酸的水溶液，梯度洗脱：0～0.25 min，A 为2%，0.26～20 min，A 由2%升至99%，保持至第24 min，第25 min回到初始流动相，保持5 min，为下一针进样做准备。

质谱条件：离子源温度、毛细管电压等参数值见表1。为保证质量数精度，数据采集时以亮氨酸脑啡肽（50 ng/mL，m/z556.277 1）进行实时校准。质谱条件中共包含3 个通道（Function），其中Function 1 和Function 2 为不同碰撞能量（CE）下的质谱信息，对应的CE 值分别为6 eV 和10 ～45 eV，Function 3为亮氨酸脑啡肽的实时校正质谱图。

表1 质谱采集参数Table 1 Parameters of QTOF MS

1.5 数据处理

实验数据采集和处理使用美国Waters公司的UNIFI 2.0 软件完成。在“1.4”参数条件下采集数据，数据采集完成后，建立处理方法；导入已建立的农药质谱库信息，包括化合物名称、分子式、母离子的精确质荷比、2 个以上特征碎片离子的精确质荷比、保留时间等。根据中华人民共和国农业农村部312公告［24］设置筛查参数：化合物的保留时间应至少大于死时间的2倍，目标物与参考标准品以相同条件测定所获得保留时间的绝对偏差应不大于0.2 min。母离子精确质荷比的相对偏差不大于5 ppm，子离子精确质荷比的相对偏差不大于10 ppm。同时，利用实验室质控样品进行本实验室内的筛查参数优化，兼顾同位素峰与碎片离子相对丰度比，在最优条件下进行样品筛查检索。

2 结果与讨论

2.1 筛查方法的优化

化合物质谱数据库是开展高通量筛查的基础。参考文献及农药残留相关的限量标准文件，选取包含杀虫剂、抗菌剂、除草剂、植物生长调节剂等在内的540 种农药开展筛查。配制标准溶液，在“1.4”条件下进行质谱信息采集，构建液相色谱高分辨质谱库，质谱库信息包括农药名称、保留时间、母离子和碎片离子等。

2.1.1 前处理条件优化目前水果蔬菜中农药高通量测定的前处理方法主要为QuEChERS 法，该法具有简单便捷、快速准确、成本低廉等优点。本研究通过加标实验对QuEChERS 方法的提取溶剂和净化填料进行优化，兼顾数据库中540种农药的种类和化学性质，选取50种农药（表2）开展方法学考察，这50种药物的辛醇水分配系数为-0.9～6.7，覆盖范围广，具有较强的代表性。

表2 代表性农药在鲜桃中的加标回收率Table 2 Spiked recoveries of the representatives pesticides in fresh peach samples

乙腈是QuEChERS方法中最常用的有机提取溶剂，实验对比了乙腈和含有1%乙酸的乙腈溶液的提取效果。结果表明酸化乙腈能增强化合物的质谱响应，因此采用1%乙酸乙腈进行提取。桃中含有多种糖类、氨基酸、维生素、膳食纤维等，为降低这些内源性物质对目标化合物的影响，需对提取液进行净化处理。对比了分散填料C18、PSA、石墨化炭黑（Carb）单独处理或复配处理的净化效果，样品中50种加标化合物经不同填料处理后回收率大于60%的农药种数见图1。结果显示，仅使用1种填料时，尽管PSA 的效果优于C18，但88%的农药在鲜桃基质中的抑制效应较明显；当PSA 与Carb联合使用时，基质抑制的农药比例降为58%，推测是两种填料可有效去除鲜桃中有机酸、色素等干扰物质的缘故。由于Carb 的用量增加可以降低基质效应，故进一步对Carb 的使用量进行优化。发现对于1 mL 提取液，使用25 mg PSA 和7.5 mg Carb 可去除干扰，有效净化目标化合物。因此本实验采用1%乙酸乙腈提取后，取1 mL提取液用25 mg PSA和7.5 mg Carb净化。

图1 经不同净化填料处理后回收率高于60%的农药种数Fig.1 Number of pesticides with recoveries higher than 60% in peach samples after purifed with different fillers extract solution volume：1 mL

2.1.2 方法确证在质谱检测中目标化合物的电离易受到基质的干扰，导致离子抑制或增强，使得基质匹配标准溶液的响应值与纯溶剂的响应不一致，且不同化合物受到的基质影响不同。当基质效应过大时，会降低灵敏度，影响方法准确性，因此需要对基质效应进行评价。基质效应（ME）%=基质匹配峰面积/纯溶剂峰面积×100%。ME%大于120%为基质增强效应，小于80%为基质抑制效应。结果表明，所选取的50 种农药中32%属于基质增强效应（122%～160%），50%属于基质抑制效应（38.7%～79.4%）。

用基质配制标准系列浓度，利用最低浓度母离子提取离子色谱峰的信噪比（S/N）推算目标物农药的检出限（LOD，S/N=3）和定量下限（LOQ，S/N=10）。结果表明，目标农药在鲜桃中的LOD 为0.1～5.0 µg/kg，LOQ 为0.4～15 µg/kg。

为最大限度消除基质效应的干扰，采用基质匹配标准曲线法进行定量分析。在均质的空白样品中加入适量混合标准溶液，添加高、中、低3个浓度水平，每个水平设6个平行，计算目标化合物的回收率和相对标准偏差（RSD）。结果表明，代表性化合物的回收率为70.3%～127%（表2），RSD为0.60%～23%。表明该方法具有良好的准确度和精密度。

（续表2）

2.2 样品筛查及定量

23 份样品经“1.3”方法处理后，采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱的MSE模式进行质谱信息采集，获得样本的总离子流图，利用本实验室建立的农药谱库进行筛查，筛出的物质详细信息见表3。在23 份桃样本中检出33 种农药，其中杀虫剂占49%（16 种），抗菌剂占33%（11 种），其余为除草剂和植物生长调节剂（图2）。检出频率最高的农药包括杀虫剂除虫菊素和抗菌剂吡唑醚菌酯（图3）、氧化萎锈和苯醚甲环唑，在15 份样本中均有检出，检出率为65%；其次是新型抗菌剂8-羟基喹啉，检出率61%。所有样品均有一种或多种农药检出，有两种以上农药同时检出的样本，大多是一种或两种杀菌剂和一种或多种杀虫剂共残留。

图2 鲜桃样品中农药的检出情况Fig.2 Detection of pesticides in fresh peach samples

图3 抗菌剂吡唑醚菌酯在标准品（上）及鲜桃样品（下）中的色谱图及对应的质谱碎片图Fig.3 The chromatograms and mass fragments of pyraclostrobin in standard（up） and fresh peach samples（down）

表3 鲜桃中筛查出的农药种类及信息Table 3 The pesticide information screened from the fresh peach samples

采用基质校准曲线对23份鲜桃样品中检出的33种农药进行定量，结果见表4。从检出浓度来看，90%的检出含量小于0.1 mg/kg；超过1 mg/kg的农药有3种，分别是多菌灵（2.10 mg/kg）、丙环唑（1.80 mg/kg）和肟菌酯（1.80 mg/kg）。筛查出的33种农药中有18种农药在GB2763-2021《食品中农药最大残留限量》［3］中有最大残留限量标准，其余无相关限量标准。共检测到抗菌剂多菌灵和氟硅唑超标样本各1份。

表4 鲜桃中的农药残留情况Table 4 The residue of pesticides in fresh peach samples

2.3 与文献比较

本研究在不同产地的桃样品中检出了33 种农药残留，高检出率的农药包括抗菌剂（吡唑醚菌酯、氧化萎锈、苯醚甲环唑）、杀虫剂（除虫菊素）等。Li等［12］在300余份鲜桃样品中检出了39种农药，样本总检出率为92.3%。本研究的检出种数和检出率与之相当，但具体农药种类有所差异，两者检出的农药中有10种相同，包括抗菌剂5种（多菌灵、嘧菌酯、苯醚甲环唑、氟硅唑和戊唑醇），杀虫剂5种（啶虫脒、灭幼脲、甲基毒死蜱、哒螨灵和螺螨酯），文献［12］的检出含量为0.001～3.4 mg/kg，稍高于本研究；除此之外，其余20余种农药各不相同，说明桃种植过程中的农药使用非常多样化。Costa等［10］在新鲜桃中检出戊唑醇、苯并环唑、马拉硫磷等，Liu 等［25］在水果中检测到多菌灵，Bibi等［26］在橘类水果中检出莠去津和嘧菌酯，Jafarian 等［27］在枣中检测到甲草胺和螺螨酯。本实验检出的农药与上述报道中的检出农药一致，说明这些农药在水果栽培中被广泛使用。但是本文中氯芬新、多效唑、溴虫腈等未被推荐用于桃的农药也被检出，且最高残留浓度为0.071 mg/kg，说明果农或种植企业未遵循用药指导，或者果园内不同水果未区分用药。考虑到这些药物的潜在危害，需进一步开展残留水平监测和健康暴露评估，为相关部门做好用药监管和控制提供技术支持。

3 结 论

农药残留的高通量筛查离不开快速可靠的提取净化前处理技术和强大的仪器分析技术。本研究基于改良的QuEChERS 技术建立了桃中农药残留的高通量筛查前处理方法，代表性农药经样品前处理及分析，回收率均在70%～130%之间，RSD 小于25%，满足高通量监测的技术指标要求。对23 份桃样品进行筛查，共检出33种农药，其中杀虫剂16种，抗菌剂11种，其余为除草剂和植物生长调节剂。

由于样本数量有限，筛查结果不能代表相关产品的残留情况。后续会进一步收集不同产地的桃样品进行分析，以更准确更全面地反映农药使用情况，为食品安全管理提供更充分的数据支持。