基于超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱对西藏不同产地甘青青兰的差异性成分分析

段婷引，达娃卓玛，兰 钧，李雪敏，张梦姣，周 燕，邓 放*

（1.成都中医药大学 药学院，西南特色中药资源国家重点实验室，四川 成都 611137；2.西藏自治区食品药品检验研究院 中药（藏药）质量控制重点实验室，西藏 拉萨 850000；3.中国科学院成都生物研究所，四川 成都 610041）

藏药材甘青青兰（Dracocephalum tanguticum Herba）又名“唐古特青兰”“陇塞青兰”，藏语名为“则羊古”［1］，为唇形科（Labiatae）青兰属（Dracocephalum）植物甘青青兰（Dracocephalum tanguticumMaxim.）的干燥地上部分［2］，生长于海拔1 900～4 000 米的干燥河谷河岸、田野、草滩或松林边缘。其茎细，叶小青色、花为蓝色，具有清肝热、止血、愈疮、干黄水等功效［1］。甘青青兰的化学成分复杂，含有挥发性成分、多糖类、黄酮类、萜类及有机酸类成分［3］。现代药理学研究表明甘青青兰具有抗氧化、抗缺氧、抑菌、抗病毒和保肝等活性［4］。

目前，对甘青青兰的化学成分研究主要采用溶剂提取、柱层析分离制备结合核磁鉴定的方法，该方法繁琐、耗时耗力［5］。近年来，随着气相色谱和液相色谱在药材成分分析中的广泛应用，特别是液相色谱-高分辨质谱联用技术应用于化学成分分析，具有高选择性、高灵敏度、高准确度的特点，可提供化合物结构信息，实现甘青青兰化学成分的快速鉴定。甘青青兰虽在藏东、藏南、川西、青东和甘南均有分布，但青藏高原才是道地产区及核心产区，根据资源普查结果，西藏至少有44个县区分布着甘青青兰［1］。本研究收集了藏东、藏南部分地区的甘青青兰，采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱（UHPLC-Q/Orbitrap HRMS）技术对不同地区甘青青兰的差异性化学成分进行分析，以期为甘青青兰质量控制研究及资源开发提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用仪（美国赛默飞世尔科技公司）；BSA124S万分之一天平（德国Sartorius公司）；BT25S型十万分之一分析天平（德国Sartorius公司）；PCWJ-10超纯水机（成都品成科技有限公司）；SK3300HP型数控超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）。

乙腈（色谱纯）、甲酸（质谱纯）均购于美国赛默飞世尔科技公司；纯净水（陕西娃哈哈乳品有限公司制造）；对照品：迷迭香酸（MUST-21111817）、金合欢素（MUST-22100813）、丹酚酸B（MUST-22101219）均购自成都曼斯特生物科技有限公司；芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷（PCS-200313）、新绿原酸（PCS-220404）、木犀草苷（PCS-200816）、隐绿原酸（PCS-220912）、蒙花苷（PCS0629）均购自成都植标化纯生物技术有限公司；香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷（wkq22072903）购自四川省维克奇生物科技有限公司；绿原酸（PS0131-0025）、香叶木苷（PS012991）购自成都普思生物科技股份有限公司，以上对照品纯度均不低于98%。

1.2 样 品

甘青青兰样品共采集41 批，其中山南市11 份、拉萨市10 份、昌都市20 份，均为一年生，夏季7月采收。不同来源的干燥样本的叶子数量略有差异，且各自的粉末颜色与细腻程度也有差别，其中以昌都样本叶子最多，粉末最为细腻且为嫩绿色，山南市样本茎枝最多，粉末较为粗糙，有较多粗纤维，颜色为浅棕色。经西藏自治区藏医院格桑巴珠副主任药师鉴定为唇形科青兰属植物甘青青兰Dracocephalum tanguticumMaxim.干燥地上部分。

1.3 溶液配制

1.3.1 对照品溶液的配制取上述对照品适量置于10 mL量瓶中，加入二甲基亚砜溶解后，用甲醇定容制备成1.0 mg/mL 的单一对照品储备液。精密量取各储备液适量，置于10 mL 量瓶中，加入甲醇定容、摇匀，得各对照品质量浓度均约为10 µg/mL的混合对照品溶液。

表1 甘青青兰样品采集信息Table 1 Collection informations of Ganqingqinglan samples

1.3.2 供试品溶液的制备取甘青青兰适量，粉碎，过二号筛，精密称定0.50 g，加入70%甲醇25 mL，超声提取60 min，冷却至室温后补足失重，摇匀，过0.22 µm 滤膜，即得供试品溶液。取供试品溶液各1 mL，等容混匀，过0.22 µm滤膜，即得QC样本溶液。

1.4 色谱及质谱条件

1.4.1 色谱条件ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm× 100 mm，1.7 µm），流动相A 为0.1%甲酸水，流动相B 为乙腈，梯度洗脱：0～2 min，5%～10% B；2～6 min，10%～15% B；6～17.5 min，15% B；17.5～18 min，15%～19% B；18～21 min，19%～25% B；21～26 min，25%～30% B；26～31 min，30%～90%B。柱温为40 ℃，流速为0.3 mL/min，进样量为2 µL。

1.4.2 质谱条件电喷雾离子源，正、负离子模式检测。喷雾电压：3.5 kV（+）、3.2 kV（-）；鞘气（N2）：8 L/min（+）、16 L/min（-）；辅助气（N2）：2 L/min（+）、3 L/min（-）；离子传输管温度：320 ℃；离子透镜电压（S-LensRF Level）：55；归一化碰撞能（NCE%）：20、40、60；检测方式：全扫描/数据依赖二级扫描（Full MS/ddMS2），一级分辨率为70 000，二级分辨率为17 500；质量扫描范围：m/z100～1 500。

1.5 数据分析

1.5.1 化合物鉴定采用UHPLC-Q/Orbitrap HRMS 分别在正、负离子模式下检测和采集数据，得到总离子流图。首先，检索国内外相关文献，整理甘青青兰及其种属的已知化学成分，构建甘青青兰的化学成分信息表。同时，采用Xcalibur 软件采集质谱数据，Compound Discoverer 3.2 软件进行分析处理，选用天然产物未知化合物鉴定模板，对未知化合物进行分子式拟合，并根据精确相对分子质量和二级碎片离子信息等结合Chemspider 和mzCloud 等数据库进行匹配。根据二级质谱裂解碎片信息，进行相关化学结构的推导，总结出特征碎片，并通过比对对照品、参考相关文献和利用MassFrontier 8.0质谱解析软件对化合物进行鉴定。

1.5.2 统计学分析将41 批甘青青兰质谱数据导入Compound Discoverer 3.2 软件进行处理，将得到的数据导入SIMCA14.1 软件，通过主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）对各产地的甘青青兰样本进行比较，以变量对模型的重要性（VIP）值大于1且P＜0.05作为条件筛选差异化合物。

2 结果与讨论

2.1 甘青青兰化学成分分析

实验前期，对甘青青兰的提取溶剂、流动相及洗脱梯度进行考察，发现以70%甲醇提取，采用“1.4.1”的色谱条件进行洗脱，所得的总离子流图峰形良好且离子峰分离较好（见图1）。

图1 甘青青兰样品（A、B）与对照品（C、D）的总离子流图Fig.1 Total ion chromatograms of Ganqingqinglan samples（A，B） and reference samples（C，D）

通过UPLC-Q-Qrbitrap HRMS 分析技术，从甘青青兰中共鉴定出73 种化合物，包括黄酮类化合物41种，有机酸类15种，氨基酸类8种，其他类9种，其中11种成分由对照品比对鉴定。

2.2 主成分分析

对Compound Discoverer 3.2软件分析出的化合物进行过滤，以变异系数CV＜50%作为筛选条件，最终得到3 085个化合物特征离子。将41批甘青青兰样本及6个QC 样本数据导入SIMCA14.1软件进行主成分分析（图2A）。图中QC 样本聚集于模型中央，证明采用的样品处理和仪器分析方法稳定，且重复性良好。山南市样本、拉萨市样本、昌都市样本各自成组，这也与甘青青兰样本的叶子数量和粉末颜色深浅相关。甘青青兰中黄酮类化学成分占比最多，而黄酮类成分合成受光照强度影响较大，山南地区山高谷深，年平均日照数最少，拉萨市、昌都市次之，但昌都市水资源丰富且气候区域性差异大，日温差大适合植物积累养分，有利于甘青青兰生长，因此推测光照日长与日温差对甘青青兰化学成分及其性状有影响。

图2 不同地区甘青青兰的PCA得分图（A）、OPLS-DA得分图（B）、随机置换检验图（C）及两组间的OPLS-DA得分图（D～F）Fig.2 PCA score plot（A），OPLS-DA score plot（B），permutation test plot（C） of Ganqingqinglan samples from different regions and OPLS-DA score plots between the two groups（D-F）

2.3 OPLS-DA分析

对3组样本进行有监督OPLS-DA分析（图2B），其模型参数R2X=0.824，R2Y=0.982，Q2=0.969。对模型进行200 次随机置换检验（图2C），检验参数R2X=0.034 9＜1，Q2=-0.592＜0.05，证实所建OPLSDA 模型可解释和预测能力高，拟合良好。将3组样本进行两两比较，并结合VIP＞1，P＜0.05筛选变化显著的差异代谢物。在SN 与LS两组样本间共筛选鉴定出11个差异化合物（图2D），SN 与CD 两组样本间共筛选鉴定出18个差异化合物（图2E），LS与CD 两组样本间共筛选鉴定出21个差异化合物（图2F）。大多数差异化合物为黄酮类及有机酸类化合物（表2）。绿原酸、金合欢素、柳穿鱼黄素是3组样本共同的差异化合物，以相对峰面积作为计算数值，其中绿原酸在三组之间的含量差别最大，在CD组含量最高（约为11.85 mg/g），LS 组次之（约为7.85 mg/g），SN 组最低（约为5.30 mg/g），推测光照时长与日温差对甘青青兰合成绿原酸的影响较大。绿原酸在甘青青兰中的含量较为丰富［2］且具有抗炎、抗病毒、抗氧化以及保肝的作用［16-17］。从公元8 世纪开始，甘青青兰清肝热的功效就已被世人承认，到公元17世纪还发现其具有止血、干黄水、收敛伤口等功效［1］，因此推测绿原酸是甘青青兰的药效物质基础之一。《晶珠本草》中提到：“青兰阴阳二坡皆生。”西藏多高山，阴坡处甘青青兰叶子少，阳坡处叶子多，可见地理环境的差异可能对甘青青兰的性状及化学成分有显著影响。

（续表2）

3 结 论

本研究采用UHPLC-Q/Orbitrap HRMS 技术联合多元统计学对3 批西藏不同地区甘青青兰样本进行分析，从甘青青兰中共鉴定出73 种化合物，包括黄酮类化合物41 种，有机酸类15 种，氨基酸类8 种，其他类9 种，并且发现不同地区的甘青青兰样本化学成分存在差异，结合不同地区地理环境，推测光照日长及日温差对甘青青兰化学成分有影响。绿原酸是不同地区甘青青兰样本中含量差异较大的化合物，同时也是含量较为丰富的化学成分之一，因此推测绿原酸是甘青青兰的药效物质基础之一，而产地差异可能会影响甘青青兰质量。以上数据可为甘青青兰的质量控制及后续合理开发利用提供理论基础。