9种重楼属植物叶中甾体皂苷成分差异的研究

李龙星 李海峰 王成军*

1.云南省滇西抗病原植物资源筛选研究重点实验室(培育)，云南 大理 671000；2.大理大学药学院，云南 大理 671000；3.大理大学分析测试中心，云南 大理 671000

重楼属(ParisL.)为百合科(Linnaeus)草本植物，全世界有 24 种，我国有 19 种，主要分布于云南、广西、四川等地，其中七叶一枝花ParispolyphyllaSm.var chinensis (Franch.)和滇重楼ParispolyphyllaSm.var.yunnanensis (Franch.)被历版《中华人民共和国药典》所收载，是重楼药材的基源植物，重楼药材以干燥根茎入药[1]，具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊之功效，可用于咽喉肿痛、毒蛇咬伤、跌打伤痛等症的治疗[2-3]，是云南白药、宫血宁胶囊、季德蛇药等著名中成药的主要原料，甾体皂苷类物质是其主要有效成分[4]，重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ总含量是《中国药典》(2020 版一部)用于质量控制的指标性成分[5]。

云南是重楼药材的主要来源地，经过长期无序大量的野生采挖，致使资源日渐枯竭，野生资源濒临灭绝[4]。因金线重楼、南重楼、毛重楼、黑籽重楼等重楼属植物根茎与七叶一枝花及滇重楼根茎植物学形态无显著差异，所以在云南金线重楼、南重楼、毛重楼、黑籽重楼等重楼属植物作为重楼药材替代品销售入药现象极其普遍，这势必影响到与其相关中成药的品质。重楼属植物甾体皂苷类物质是在植物叶绿体中合成，经茎向下运输，主要在根茎中积累和储存[1]。笔者前期研究[6-7]发现，黑籽重楼、长柱重楼与滇重楼、滇重楼(阔瓣)、金线重楼、毛重楼、五指莲、多叶重楼、南重楼等重楼属植物根茎中甾体皂苷类物质差异较大，这种差异可能与不同品种重楼属植物甾体皂苷类物质在植物叶绿体中生物合成差异有关，是导致重楼属植物品质差异的根本。因此，本研究拟采用液质联用技术(UPLC-ESI-Q-TOF-MS)对9种重楼属植物叶中甾体皂苷类物质进行定性分析[8-10]，以及质荷比(m/z)50～2000 Da之间的主成分(principal component analysis，PCA)及主要差异峰进行分析，为9种重楼属植物叶中甾体皂苷类物质差异及其利用提供依据。

1 材料

2020年9月，在云南大理、保山等地采集重楼属植物样品，植株样品由大理大学李海峰教授鉴定，见表1，新鲜样品自然干燥，备用。

表1 重楼属药用植物样品信息表

对照品重楼皂苷Ⅰ(批号111590-2004022)，重楼皂苷Ⅱ(批号111591-200301)，重楼皂苷Ⅵ(批号111591-200301)，重楼皂苷Ⅶ(批号111590-200402)，均购自中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱纯，水为超纯水，无水乙醇等均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 9种重楼属植物叶中甾体皂苷有效成分的测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱为Dionex-C18(150 mm×2.1 mm，3 μm)；流动相水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱：0～12 min B相为45%～60%，12～25 min B相为60%～30%，25～28 min B相为30%～100%，28～30 min B相为100%，30～35 min B相为100%～45%，35～40 min B相为45%；检测波长203 nm；柱温30 ℃；流速0.2 mL·min-1；进样量10 μL。

2.1.2 质谱条件 参照笔者建立的方法[6-7]，Bruker Q-TOF-MS质谱系统，离子源为电喷雾离子源，正离子模式扫描，离子源温度是220 ℃，金属毛细管电压是4000 V，终板抵消电压是500 V，雾化器压力是253.8 kPa，干燥气体是氮气，干燥温度是350 ℃，气体流速每钟8 L，扫描质量范围m/z 50～2000 Da，碰撞气体氩气，扫描碰撞能量 8 eV，六级杆射频电压是70 Vpp，四级杆离子能量是8 eV，质量数用Na[NaCOOH]溶液作校正。

2.1.3 混合对照品溶液的制备 在十万分之一分析天平上分别精密称取重楼皂苷Ⅰ1.13 mg、重楼皂苷Ⅱ1.02 mg、重楼皂苷Ⅵ1.16 mg、重楼皂苷Ⅶ1.08 mg对照品，加入到10 mL容量瓶，加甲醇溶解，稀释至刻度定容，混合均匀，即得 0.113 mg·L-1、0.102 mg·L-1、0.116 mg·L-1、0.108 mg·L-1重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ混合对照品溶液，4 ℃冷藏，备用。

2.1.4 9种重楼属植物叶供试品溶液的制备 分别取9种重楼属植物叶，细粉，干燥箱中40 ℃干燥到恒重，过100目筛，分别在50 mL玻璃三角瓶中精密称取9种重楼属植物叶样品粉末 0.1000 g，分别加75%乙醇4 mL，40 ℃ 40 kHz 超声浸提20 min，过滤，收集滤液，滤渣分别用 2 mL 75%乙醇重复超声浸取2次，合并3次浸提液，加入到10 mL容量瓶，冷却到室温，加乙醇溶液至刻度定容，混全均匀，即得9种重楼属植物叶供试品溶液，液质联用进样前用0.22 μm微孔有机相滤膜过滤。

2.1.5 方法专属性 分别在正离子和负离子模式下对重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ混合对照品溶液进行液质联用测试，结果显示，在正离子模式下混合对照品溶液质谱响应较好，负离子模式下混合对照品溶液响应较小，所以实验在正离子模式下进行定性分析，分别得到重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ混合对照品溶液色谱图(A)和总离子流图(B)，结果如图1所示，方法专属性良好。

1.重楼皂苷Ⅶ；3.重楼皂苷Ⅵ；4.重楼皂苷Ⅱ；7.重楼皂苷Ⅰ

2.2 9种重楼属植物叶中甾体皂苷有效成分分析 分别取“2.1.3”重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ混合对照品溶液及“2.1.4”9种重楼属植物叶供试品溶液，在“2.1.1”及“2.1.2”项下进行液质联用测定，每个样品进样10 μL，分别测得重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ混合对照品及9种重楼属植物叶的质谱数据，用Bruker Daltonics公司Data Analysis数据处理软件进行数据分析，并与重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ对照品溶液质谱数据进行匹配，分析并鉴定9种重楼属植物叶中甾体皂苷类物质。在正离子扫描模式下，用甲酸钠质荷比m/z 90.9766进行电喷雾离子源内部校正，模式为HPC，搜索范围为0.05，强度为1000，设置micrQ-TOF外标法最大误差为m/z>400(5 ppm)或m/z<400(4 mDa)。使用Chemistry对9种重楼属植物叶中甾体皂苷类物质进行定性分析，用Smart Formula计算质谱图中所出峰分子式，Smart Formula Manually计算某一特定m/z峰的分子式，选中质谱图中分子离子峰，输出相应分子离子峰的分子式。

2.3 9种重楼属植物叶中主成分PCA模型的建立 将“2.2”测得的9种重楼属植物叶中质谱数据导入Bruker Daltonics公司Profil Analysis软件，再根据9种重楼属植物进行单因素分组建模，建立PCA模型，分析9种重楼属植物叶中主成分差异。质量范围设为50～2000 m/z，时间范围设为0.2～40 min，时间容差设为2 min，质量容差设 1.0 m/z，强度归一化，无数据前处理，无背景扣除，无干扰峰扣除。

2.4 9种重楼属植物叶中甾体皂苷类物质的测定 对金线重楼、毛重楼、南重楼、黑籽重楼、长柱重楼、多叶重楼、滇重楼(阔瓣)、七叶一枝花、滇重楼植物叶进行液质联用测定，分析正离子模式进行质谱数据，结果表明，正离子模式下9种重楼属叶中主成分均有较好的响应，所以用正离子模式下数据进行质谱分析，得到9种重楼属植物叶的色谱图(a)和总离子流图(b)，如图2所示。

图2 重楼属植物叶色谱图(a)和总离子流图(b)

2.5 9种重楼属植物叶中主要甾体皂苷有效成分分子式分析 对所测得的9种重楼属植物叶质谱数据进行分析，并与重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ对照品质谱数据进行匹配，以及结合部分碎片信息、笔者前期建立的化合物库信息、文献报道，鉴定9种重楼属植物叶中甾体皂苷类物质，得到9种重楼属植物叶中分子离子峰所对应的样品理论分子量及误差，结果见表2、表3。

表2 重楼属9种植物叶中主要甾体皂苷有效成分理论分子量及误差比较

如图3所示，2号峰在正离子模式可见m/z 871.4623 [M+H]+和m/z 893.4598 [M+Na]+，结合出峰时间与离子碎片可推测为重楼皂苷 H(C44H71O17，3-O-α-L-rha(1→2)[α-L-ara(1→4)]-β-D-glc)。如图4所示，5号峰在正离子模式可见m/z 869.4948 [M+H]+和m/z 891.4685 [M+Na]+，结合出峰时间、离子碎片综合推测为纤细薯蓣皂苷(Dioscin，C45H72O16，3-O-α-L-ha(1→2)[α-L-rha (1→4)]-β-D-glc)。如图5所示，6号峰在正离子模式可见m/z 885.4626 [M+H]+和m/z 907.4419 [M+Na]+，结合出峰时间、离子碎片综合推测为纤细薯蓣皂苷(Gracillin，C45H72O17，3-O-β-D-glc (1→3)[α-L-rha(1→2)]-β-D-glc)。如图6所示，8号峰在正离子模式可见m/z 723.4260 [M+H]+和m/z 745.4223[M+Na]+，结合出峰时间、离子碎片综合推测为重楼皂苷Ⅴ[C39H62O12，3-O-α-L-rha(1→2)-β-D-glc]。

图3 重楼皂苷H质谱图

图4 薯蓣皂苷质谱图

图5 纤细薯蓣皂苷质谱图

图6 重楼皂苷Ⅴ质谱图

A.重楼皂苷H；B.薯蓣皂苷；C.纤细薯蓣皂苷；D.重楼皂苷Ⅴ

2.6 9种重楼属植物叶中主成分PCA分析 分析9种重楼属植物叶中正离子模式下质谱质数据主成分PCA及主要差异峰，PCA主成分 (图8)及主要差异峰(图9)结果表明，在PC第一维度，9种重楼属植物叶中主成分能够得到较好的分离，可大致聚为四类。其中CZCL(长柱重楼)、JXCL(金线重楼)、DCL(滇重楼)、DYCL(多叶重楼)、NCL(南重楼)、YZH(七叶一枝花)分布集中，可以聚为第一类，主要化学成分无显著差异；MCL(毛重楼)可聚为第二类，与重楼属6种植物之间距离最近，主成分差异最小；HZCL(黑籽重楼)可聚为第三类；KBCL[滇重楼(阔瓣)]可聚为第四类，与重楼属6种植物之间距离最远，主成分差异最大。且从分析结果可得在30.70 min，450.500 m/z(A)；14.70 min，330.500 m/z(B)；6.70 min，382.500 m/z(C)；15.70 min，456.500 m/z(D)；10.70 min，496.500 m/z(E)；12.70 min，536.500 m/z(F)；19.70 min，480.500 m/z(G)；1.70 min；164.500 m/z(H)；1.70 min，381.500 m/z(I)；34.70 min，284.500 m/z(J)；13.70 min，496.500 m/z(K)；16.70 min，466.500 m/z(L)；11.70 min，496.500 m/z(M)这几个时间点为主要差异峰。

3 讨论

运用液质联用方法定性分析9种重楼属植物叶中重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅲ(薯蓣皂苷)、重楼皂苷Ⅴ、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷 H及纤细薯蓣皂苷等8种甾体皂苷，结果表明，金线重楼、南重楼、七叶一枝花叶中均检测到8种甾体皂苷，黑籽重楼、多叶重楼、滇重楼(阔瓣)叶中检测到7种甾体皂苷，滇重楼、毛重楼叶中检测到6种甾体皂苷，长柱重楼叶中检测到4种甾体皂苷，重楼皂苷Ⅰ、纤细薯蓣皂苷在9 种植物叶中均检测到。根据重楼属9种植物叶正离子模式下液质数据的主成分PCA模型可将滇重楼、金线重楼、长柱重楼、多叶重楼、南重楼、七叶一枝花聚一类，主要化学成分无显著差异。

虽然重楼属植物叶中甾体皂苷类物质均经异戊二烯代谢途径合成[10]，但是不同品种在不同气候、土壤等生态因子的共同作用下可能是引起重楼属植物叶中化学成分差异的根本，这种差异可能与不同品种重楼属植物甾体皂苷类物质在植物叶绿体中生物合成差异有关，是导致重楼属植物品质差异的根本。而这种差异的形成值得进一步深入探讨，为从生物合成途径研究其它重楼属植物替代滇重楼和七叶一枝花入药提供依据。

另外，云南是重楼药材的主要来源地，经过长期无序大量的野生采挖，致使资源日渐枯竭，野生资源濒临灭绝[4]。因金线重楼、南重楼、毛重楼、黑籽重楼等重楼属植物根茎与七叶一枝花及滇重楼根茎植物学形态无显著差异，该文研究结果显示8种主要甾体皂苷有效成分和化学成分种类无显著差异。用重楼茎、叶替代根茎入药值得深入研究。