基于网络药理学和分子对接探讨姜黄素治疗溃疡性结肠炎的分子机制

王闯红，常旭贞

（通渭县人民医院普外科1，病理科2，甘肃 通渭 743300）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种以结直肠黏膜及黏膜下损伤为主的连续性炎性肠道疾病，典型症状为反复腹痛、腹泻、黏液脓血便以及里急后重和体重减轻等[1]。在世界范围内UC 患病率呈上升趋势[2]。目前UC 患者经常使用氨基水杨酸、糖皮质激素、免疫调节药物和生物制剂，但以上药物易导致感染、骨质疏松和抑郁等不良反应，甚至还会引起抗原抗体反应[3]。即使经过规范的药物治疗，仍有20%～30%的患者由于药物治疗失败或长期结肠炎继发发育不良需接受手术治疗[4]。姜黄素是姜黄、郁金等姜科姜黄属中药中的主要活性成份，具有较好的抗炎、改善免疫功能及抗氧化、抗肿瘤等多种药理作用[5]。临床研究发现[6]，补充姜黄素可显著改善轻至中度UC 患者的临床结局和生活质量，然而姜黄素改善UC 机制至今尚未完全明确。网络药理学作为一门基于系统生物学、生物信息学和高通量组织学的全新学科，基于公共数据库用于发现生物活性成分，预测药物作用靶点以及从生物网络平衡的角度分析药物作用机制[7]。因此，本研究利用网络药理学方法，预测姜黄素在UC 治疗中的有效分子靶点和潜在机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 姜黄素作用靶点获取 将姜黄素英文名称“curcumin”输入TCMSP 数据库（https://www.tcmsp-e.com/tcmsp.php）和Drugbank 数据库（https://go.drugbank.com/）进行检索，收集姜黄素潜在作用靶点。将“curcumin”输入PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获得姜黄素的2D 化学结构及SMILES 符号，上传SDF 格式2D 化学结构文件至PharmMapper 数据库（http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/index.html）进行模拟分子-靶蛋白对接，设置靶点类型为“human protein targets only”，获得潜在作用靶点。同时将姜黄素SMILE 符号上传至SwissTargetPrediction 数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/），选择物种为“homo sapiens”，获得潜在作用靶点，并从中筛选出可能性（probability）大于0的靶点。将上述靶点合并去重，利用Uniprot 网站（https://www.uniprot.org/）对剩余靶点进行标准化转换，得到目的基因名称。

1.2 UC 疾病靶点检索 利用GeneCards 数据库（https://www.genecards.org/）、DisGeNET 数据库（https://www.disgenet.org/）、PharmGKB 数据库（https://www.pharmgkb.org/）和TTD 数据库（http://db.idrblab.net/ttd/），以“ulcerative colitis”为关键词进行人类基因检索获得疾病靶点。筛选GeneCards 数据库中相关性得分大于1 的靶点及DisGeNET 数据库评分大于0.1 的靶点。将4 个数据库中符合疾病的基因合并去重，从而获得最终疾病相关靶点基因。

1.3 UC 和姜黄素共同靶点的筛选 将“1.1”和“1.2”所获取的姜黄素靶点基因与UC 疾病靶点基因导入Venny2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）在线作图工具绘制韦恩图，获得姜黄素与UC 的共有靶点基因。

1.4 蛋白互作网络构建及核心靶点筛选 将姜黄素与UC 的共有基因靶点导入STRING 数据库（https://cn.string-db.org/cgi/input.pl），设定物种为“homo sapiens”，最高置信度为0.9，构建共有靶点基因的蛋白互作关系（protein-protein interaction,PPI）网络，隐藏PPI 网络中孤立的靶标基因，导出tsv.相关信息文件，运用Cytoscape3.9.1 软件进行可视化分析，计算网络拓扑学参数并筛选核心靶点。

1.5 生物功能与通路富集分析 利用DAVID 数据库（https://david.ncifcrf.gov/）将姜黄素与UC 的共有靶点基因进行基因本体论（gene ontology，GO）功能注释和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。以＜0.05 作为显著功能和通路的临界值，按照值从小到大进行排序，分析姜黄素治疗UC 的主要生物功能以及信号通路。

1.6 核心靶点的分子对接验证 选择核心靶点蛋白分子进行分子对接验证。从Protein Data Bank 数据库（https://www.rcsb.org/）下载核心靶点蛋白的3D 结构。利用AutoDockTools 1.5.6 软件将蛋白受体和姜黄素分子配体进行分子对接，通过结合能评估配体和受体的结合能力，结合能小于-5.0 kcal/mol 时具有良好的对接活性。采用PyMol2.2.0 软件进行可视化展示。

2 结果

2.1 姜黄素治疗UC 的潜在靶点 基于TCMSP 数据库收集到姜黄素中所包含的靶点2 个，Drugbank 数据库中收集到5 个，PharmMapper 数据库收集到291 个，SwissTargetPrediction 数据库收集到47 个。合并去重后，最终得到姜黄素潜在作用靶点324 个。将GeneCards、DisGeNET、PharmGKB 和TTD 4 个数据库中检索到的UC 相关靶点基因合并去重，共收集到UC 相关基因2907 个。通过韦恩图取交集，共获得姜黄素治疗UC 潜在靶点基因168 个，见图1。

图1 姜黄素和溃疡性结肠炎共有靶点韦恩图

2.2 蛋白质相互作用（PPI）网络构建与分析 PPI 网络中共有133 个节点，1082 条边（在STRING 数据库中设置最高置信度为0.9，并隐藏孤立节点，所以有35 个交集靶点基因未参与网络构建），见图2。以Degree 值＞50 为筛选条件，获得姜黄素治疗UC 的关键靶点有SRC、MAPK1、STAT3、AKT1、HSP90AA1及PTPN11，其网络拓扑学参数见表1。

表1 PPI 网络核心靶点的拓扑学参数

图2 姜黄素治疗溃疡性结肠炎潜在靶蛋白PPI 网络图

2.3 GO 功能注释分析 将药物疾病共有靶点进行蛋白功能注释分析，包括生物过程、分子功能以及细胞成分，将校正＜0.05 的条目进行筛选，分别选取值最小的前10 位作图，结果显示生物过程包括485 个条目，主要涉及凋亡过程的负调控、肽基酪氨酸磷酸化、蛋白质磷酸化等；分子功能包括108 个条目，主要涉及跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、相同蛋白质结合等；细胞成分包括66 个条目，主要涉及胞质溶胶、细胞外外泌体、细胞外区等，见图3。

图3 姜黄素治疗溃疡性结肠炎作用靶点GO 功能分析

2.4 KEGG 通路富集分析 将药物疾病共有靶点进行KEGG 通路富集分析，将校正＜0.05 的条目进行筛选，总共富集到147 条信号通路。将得到的结果按值进行排序，选取值最小的前20 条通路进行可视化分析，结果显示这些靶点主要汇集在癌症通路、脂质和动脉粥样硬化、癌症中的蛋白聚糖、前列腺癌、内分泌抵抗、PD-L1 在癌症中的表达和PD-1 检查点通路、C 型凝集素受体信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药等信号通路，见图4。

图4 姜黄素治疗溃疡性结肠炎作用靶点KEGG 富集气泡图

2.5 姜黄素与核心靶点蛋白分子对接情况 姜黄素与6个核心靶点蛋白的结合能均小于-5.0 kcal/mol，见表2。对接结果在PyMOL 软件中进行可视化处理，以姜黄素与SRC 对接为例，结果显示姜黄素可通过GLN-3 与SRC 形成氢键；另外，姜黄素与SRC的结合能为-5.15 kcal/mol，提示姜黄素与核心靶点SRC 的生物亲和力高，具有较高的药效活性，见图5。

表2 核心靶蛋白与姜黄素的分子对接结果

图5 姜黄素与核心靶蛋白的分子对接结果图

3 讨论

目前，临床对于UC 的发病机制尚未明确，中医学认为其病机主要以本虚为主，是本虚标实、虚实夹杂之证[8]。中医药治疗UC 具有疗效确切、多靶点调控、毒副作用小等优势。研究表明[9-11]，中药有效成分及复方治疗UC 的机制包括调节机体免疫、维持抑炎促炎因子平衡、抗氧化及调节肠道微生态等。网络药理学研究发现诸如葛根、黄芩和黄连厚朴汤等多种中药和方剂均具有抗UC 的作用靶点[12-14]。姜黄素是姜黄、郁金等姜科姜黄属中药中的主要活性成份，一项针对随机对照临床试验的研究证实[15]，姜黄素辅助治疗可有效缓解UC 患者的临床症状，而不会引起严重的不良反应。然而，姜黄素在UC 治疗中的调节机制尚未得到系统阐明。

本研究基于网络药理学方法探讨了姜黄素在UC 治疗中可能的作用机制，从公共数据库中筛选到168 个姜黄素治疗UC 的潜在靶点。GO 功能富集分析显示659 条通路，KEGG 通路富集分析显示147 条信号通路，主要与细胞凋亡过程负调控、蛋白质磷酸化、癌症相关通路、脂质和动脉粥样硬化、C 型凝集素受体信号通路等有关。血脂异常不仅与UC 等自身免疫性疾病的发病有关，而且会加速其进展[16]。研究表明[17，18]，UC 患者血清HDL-C 水平显著降低、LDL-C 水平显著升高，而姜黄素能够影响脂质代谢，从而缓解高脂血症和动脉粥样硬化。C 型凝集素受体（C-type lectin receptors，CLRs）主要由抗原呈递细胞表达，是识别内源性分子和病原体上碳水化合物结构的模式识别受体[19]，在调节肠道免疫稳态和结肠炎症中起着至关重要的作用。Mincle是一种主要由巨噬细胞诱导的CLR，介导宿主内的各种促炎反应，研究发现其可作为UC 的潜在治疗靶点[20]，而姜黄素能够通过抑制Mincle 维持的M1巨噬细胞表型从而减轻炎症反应[21]。

根据姜黄素与UC 共有靶点基因的PPI 网络，筛选出6 个关键靶点基因：SRC、MAPK1、STAT3、AKT1、HSP90AA1 及PTPN11。分子对接结果表明，姜黄素对这些靶标具有良好的亲和力，其中STAT3结合度最高。SRC 是一类非受体酪氨酸激酶，通过催化ATP 末端的磷酸基团转移到特定蛋白质底物上的酪氨酸残基来激活下游信号分子，从而转导生物信号，是细胞生理过程的重要调节剂[22]。UC 的病理特征之一是杯状细胞丢失导致粘蛋白分泌减少，有研究发现[23]，作为SRC 家族成员之一的SRC-3 可以通过增强转录因子KLF4 的表达来改善葡聚糖硫酸钠（dextran sodium sulfate，DSS）诱导的结肠炎，促进结肠杯状细胞分化和成熟。MAPK 信号通路是与UC 发病机制密切相关的信号通路，其激活被认为是导致UC 中细胞因子和炎症介质释放的主要因素之一[24]。MAPK1 是MAPK 家族成员之一，在MAPK信号传导中起主要作用。有研究表明[25]，DSS 诱导的UC 大鼠MAPK1 的表达增加，其被抑制后可减轻炎症，促进上皮屏障功能的恢复。处于活动期的UC 患者肠道固有层中IL-6 及其受体（IL-6Rα）水平升高，IL-6 与IL-6Rα 多肽结合，后者与膜相关gp130相互作用，进而触发Janus 激酶（Janus kinases，JAK）和下游效应子、信号转导和转录激活子3（signal transducer and activator of transcription-3，STAT3）、Shp-2-Ras 和磷脂酰肌醇3'激酶（phosphatidyl inositol 3' kinase，PI3K）-AKT 信号[26]。STAT3 与特定的DNA 序列结合并调节细胞增殖、存活和血管生成调节因子的转录[27]。研究发现[28]，中药提取物木犀草素可以通过蛋白质磷酸丝氨酸磷酸酶-1（protein phosphoserine phosphatase-1，SHP-1）抑制STAT3 信号通路来保持肠道上皮屏障功能，从而缓解DSS 诱导小鼠UC 的症状。Shou X 等[29]研究发现，在青紫止痛汤治疗UC 中丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（silk/threonine protein kinase 1，AKT1）是结合活性最好的靶蛋白，提示AKT1 可能是青紫止痛汤给药后信号转导的重要介质。

根据分子质量，Hsps 分为Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60 和Hsp20 家族。Hsp90AA1 是Hsp90s中研究最广泛的成员，它在细胞质基质中的主要作用是维持蛋白质稳态并实现细胞保护功能[30]。葛根芩连汤治疗UC 在临床上使用广泛，且疗效确切。Wei M 等[31]通过网络药理学分析发现，HSP90AA1是葛根芩连汤治疗UC 的靶标之一。PTPN11 基因编码含Src 同源结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶蛋白2（Src homology domain -containing protein -tyrosine phosphatase-2，SHP-2），由PTPN11 多态性引起的SHP-2 功能丧失的积累改变可能导致对T 细胞和B细胞活化的抑制作用降低，从而导致持续的慢性肠道炎症和UC 的发作[32]。

综上所述，本研究基于网络药理学和分子对接技术预测了姜黄素治疗UC 的核心靶点和信号通路，表明姜黄素可以通过多靶点、多途径系统地改善UC。以上研究结果为未来运用姜黄素治疗UC 的新药开发和临床研究提供了理论依据，后续需进一步研究和实验验证。