姜黄素对慢性颞叶内侧癫痫大鼠脑脊液和血浆中MMP-9水平及血脑屏障通透性的影响

郭彩凤 谭燕 张岳峰 周华荣 陈国华 方雅秀 蓝晓凤

广州医科大学附属脑科医院神经科，广州 510370

癫痫（epilepsy）是大脑神经元异常放电引起的神经系统常见疾病［1］。癫痫的长期且频繁发作会对患者的神经系统产生严重的损伤，对患者的身心健康及社会功能造成严重的影响［2］。

国内外研究发现，癫痫动物模型存在血脑屏障损伤［3-4］。而血脑屏障损伤程度与慢性癫痫大鼠癫痫发作频次存在明显相关［5］。有研究指出：减轻血脑屏障损伤程度、修复受损血脑屏障、改善血脑屏障功能有助于减少癫痫发作［6］。

血脑屏障的通透性及其功能的完整性与其血管内皮细胞间的紧密连接（tight junction）有着密不可分的关系［7］。紧密连接主要由闭锁蛋白、紧密连接蛋白、claudins、跨膜蛋白和连接黏附分子组成［8］。其中，claudin-5是形成紧密连接初级结构的关键结构蛋白，它的分布和表达的变化可直接导致血脑屏障损伤［9］。基质金属蛋白酶家族（MMPs）中的MMP-9已被证实可通过降解claudin-5进而导致血脑屏障损伤的发生［10］。除此之外，MMP-9也可通过降解紧密连接蛋白ZO-1进而破坏血脑屏障的结构［11］。

姜黄素是一种从姜黄属类植物根茎中提取出来的多酚化合物［12］。其具有抗炎、抗氧化、保护或改善血管内皮功能等重要作用［13］。最近的研究发现，姜黄素可改变血脑屏障的通透性，并对血脑屏障起到保护作用［14］。然而，姜黄素是否会通过改变影响血脑屏障紧密连接的蛋白酶体系进而改变血脑屏障结构及功能仍是不明确的。

本研究通过对慢性颞叶内侧癫痫大鼠给予姜黄素干预，进一步探究姜黄素对慢性颞叶内侧癫痫大鼠癫痫发作情况的影响，同时探究姜黄素对慢性颞叶内侧癫痫大鼠血脑屏障通透性以及影响血脑屏障紧密连接的MMP-9水平的影响，为进一步明确临床上姜黄素改善血脑屏障功能及治疗癫痫的可能性提供有力证据。

材料与方法

1.材料

1.1.药物与试剂 姜黄素购自美国TargetMed公司（批号：T1534）。用二甲基亚砜把姜黄素溶解至200 g/L。锂-匹罗卡品购自上海阿拉丁公司（批号：P129680，规格：250 mg）。白蛋白检测试剂盒（BCG法）购自美国BioAssay Systems公司。大鼠MMP-9酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（货号：XY0001H594）购自上海信裕生物科技有限公司。

1.2.试验动物 Sprague-Dawley大鼠购自广东省实验动物中心（SCXK2021-0002）（6～8周，雌性，体质量160～180 g），饲养在受控环境条件下（环境温度24～25 ℃；湿度50%～60%；早上7点到晚上7点亮灯），自由获得食物和水。

2.锂-匹罗卡品诱导慢性颞叶内侧癫痫大鼠

本研究于2021年2月至2023年2月在广州医科大学附属脑科医院开展。本研究的所有大鼠均采用目前国内外公认的成熟的化学点燃方法（即锂-匹罗卡品诱导）构建颞叶内侧癫痫模型［15］：先用锂-匹罗卡品诱导大鼠出现癫痫持续状态，经过一定的潜伏期后待大鼠出现反复自发性发作后。若癫痫持续状态后2个月内出现至少2次反复自发性发作，则判定慢性颞叶内侧癫痫模型构建成功。

3.分组及处理

将所有成功构建慢性颞叶内侧癫痫大鼠随机分为2组：姜黄素组及生理盐水组，并做好标记。对于姜黄素组大鼠每天予以腹腔注射姜黄素溶液，给药剂量为100 mg/kg，给药体积为0.5 ml；生理盐水组大鼠每天予以腹腔注射0.5 ml生理盐水。干预期为4周。

4.癫痫发作监测

用录像设备记录各组大鼠的日常状况，根据Racine评分系统评分细则对各组大鼠癫痫发作情况进行判断并记录。

5.脑脊液及血标本收集

各组大鼠在建模前、药物干预前及药物干预后分别收集脑脊液及血标本各500 µl，用于脑脊液和血浆中白蛋白及MMP-9的检测。所有收集的血液样本在进行检测前均进行离心（3 000转/min，10 min）并获取血浆。

6.脑脊液及血浆标本中白蛋白和MMP-9水平检测

使用ELISA对脑脊液及血浆标本中白蛋白和MMP-9浓度进行检测。用于检测大鼠脑脊液及血浆白蛋白浓度的ELISA试剂盒购自泉州市睿信生物科技有限公司（货号：RX302891R）。用于检测大鼠脑脊液及血浆MMP-9浓度的ELISA试剂盒购自上海联硕生物科技有限公司（货号：AE90721Ra-96T）。根据各剂盒操作步骤进行各待测液中白蛋白及MMP-9水平的检测。

7.统计学分析

采用SPSS 26.0软件进行统计学分析。计量资料符合正态分布，以均数±标准差（）表示。两组间计量资料比较采用独立样本t检验，干预前后比较采用配对t检验。对于建模前、干预前、干预后的数据比较，我们采用了单因素方差分析进行，并进行了事后多重比较，以对比不同阶段各组大鼠的各项指标的变化。P＜0.05表示差异有统计学意义。

结果

32只大鼠中成功构建颞叶内侧癫痫模型大鼠17只，随其分为两组。其中，姜黄素组9只，生理盐水组8只。

1.干预前后两组大鼠癫痫发作频次改变（表1）

表1 干预前后两组慢性颞叶内侧癫痫大鼠反复自发性发作频次比较（次/4周，）

表1 干预前后两组慢性颞叶内侧癫痫大鼠反复自发性发作频次比较（次/4周，）

注：姜黄素组大鼠予以腹腔注射姜黄素（100 mg/kg）干预，生理盐水组大鼠予以腹腔注射生理盐水

组别姜黄素组生理盐水组t值P值只数9 8干预前22.330±2.398 22.750±2.375 0.382 0.723干预后21.670±2.121 21.500±2.449 0.153 0.881 t值0.618 1.035 P值0.545 0.318

干预前两组大鼠癫痫发作频次差异无统计学意义（P＞0.05）。干预后，两组大鼠癫痫发作频次差异亦无统计学意义（P＞0.05），两组大鼠癫痫发作频次与干预前相比无显著改变（均P＞0.05）。

2.建模前及干预前、后两组大鼠白蛋白商变化情况（表2）

表2 建模前及干预前、后两组慢性颞叶内侧癫痫大鼠脑脊液及血浆中白蛋白浓度变化（）

表2 建模前及干预前、后两组慢性颞叶内侧癫痫大鼠脑脊液及血浆中白蛋白浓度变化（）

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建模前，两组大鼠脑脊液白蛋白浓度、血浆白蛋白浓度、白蛋白商（白蛋白商=脑脊液白蛋白浓度/血清白蛋白浓度）差异均无统计学意义（均P＞0.05）。建模成功后，两组大鼠的脑脊液白蛋白浓度及白蛋白商均高于建模前（均P＜0.05）。给予不同的干预后，姜黄素组大鼠的白蛋白商较干预前显著下降（P＜0.05），而生理盐水组干预前、后的白蛋白商差异无统计学意义（P＞0.05）。

3.建模前及干预前、后两组大鼠脑脊液、血浆中MMP-9变化情况（表3）

表3 建模前及干预前、后两组慢性颞叶内侧癫痫大鼠脑脊液及血浆中MMP-9变化情况（μg/L，）

表3 建模前及干预前、后两组慢性颞叶内侧癫痫大鼠脑脊液及血浆中MMP-9变化情况（μg/L，）

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建模前，两组间脑脊液和血浆中MMP-9浓度差异均无统计学意义（均P＞0.05）。建模成功后（干预前），两组大鼠脑脊液中MMP-9浓度均显著高于建模前（均P＜0.05）。给予干预后，姜黄素组大鼠脑脊液中MMP-9浓度较干预前显著降低（P=0.027）。与此同时，该组大鼠血浆中MMP-9浓度也有下降的趋势，但该变化差异无统计学意义（P＞0.05）。而生理盐水组无论是脑脊液中还是血浆中MMP-9浓度与干预前相比，干预后均无显著改变（均P＞0.05）。

讨论

自1970年起，陆续有研究报道癫痫会影响血脑屏障的完整性及功能［16］。在动物模型中发现，在癫痫发作后的几分钟内，血脑屏障便出现不同程度的损伤，这种损伤可持续数小时甚至数天［3］。van Vliet等［6］的研究发现癫痫持续状态会导致血脑屏障损伤的发生，并且这种损伤的发生和发展会蔓延至慢性期，持续时长达数周至数个月不等。此外，该研究还发现血脑屏障的损伤一定程度上影响着癫痫发作的频次。这提示癫痫病情的持续可能与血脑屏障的损伤有关。

姜黄素作为从姜黄属类植物根茎中提取出来的多酚化合物，具有抗炎、抗氧化、清除氧自由基等功能，对神经系统、心血管系统等均有着保护作用［17］。本研究发现：给予姜黄素干预后，模型鼠白蛋白商（脑脊液白蛋白/血浆白蛋白比值）较干预前显著下降。这提示姜黄素在一定程度上改变了血脑屏障的通透性，这与先前的研究结果是相类似的。既往的研究表明，姜黄素可以降低氧化应激反应造成的神经系统损伤，并对受损的血脑屏障起到修复作用［18］。与此同时，本研究还发现姜黄素对脑脊液MMP-9水平有着显著的影响。而既往的研究已经指出：MMP-9可降解紧密连接中重要组成部分——claudin-5和ZO-1，从而降低血脑屏障的结构完整性，进而造成血脑屏障通透性改变和血脑屏障损伤［11］。因此，姜黄素除了通过减少因氧化应激反应造成的血脑屏障损伤外，还可能通过调节影响紧密连接结构的蛋白酶表达水平进而对血脑屏障起到保护作用。

此外，本研究结果显示：姜黄素并未对慢性颞叶内侧癫痫大鼠癫痫发作频次起到显著的影响。既往的研究结果表明：白蛋白通过破损的血脑屏障进入大脑细胞外空间后可诱导星形胶质细胞中的转化生长因子（TGF）-β/ALK5信号通路的激活，进而诱导兴奋性的突触形成，从而导致自发性癫痫的发生［19］。而当使用AT1受体拮抗剂阻断TGF-β信号通路后，有效抑制了大脑细胞外间隙中的白蛋白对脑内TGF-β通路激活的诱导作用，从而达到减少自发性癫痫发作的作用［20］。因此，血脑屏障受损修复后，白蛋白从血液中渗入脑内减少，从而一定程度地抑制癫痫发作。本研究中，所有模型鼠在接受姜黄素干预前已经存在血脑屏障损伤，即已存在白蛋白从血液中渗入到脑内的现象。而模型鼠接受姜黄素干预的时间是相对局限的，仅有14 d时间。虽然结果显示姜黄素对血脑屏障损伤程度有所逆转，但逆转的程度是否已经到达有效抑制白蛋白从血液中向脑内渗透的程度仍是不确定的。此外，姜黄素可能是通过对血脑屏障损伤进行修复并减少刺激因素——白蛋白入脑，进而进一步抑制癫痫发生，而并不一定对干预前已渗入到脑内并可引起癫痫发作的白蛋白起到清除作用。在有限的干预时间内，姜黄素的修复效果还未达到完成修复且脑内渗入的白蛋白仍未被有效清除，模型鼠的癫痫发作状况也可能因此而未有明显改善。因此，姜黄素对癫痫发作的影响是否受到疗程和治疗剂量的影响仍需进一步研究和探讨。

姜黄素可能通过改变脑脊液中MMP-9水平来改变慢性颞叶内侧癫痫大鼠血脑屏障紧密连接的结构和功能，从而改变血脑屏障的通透性，进而对受损的血脑屏障起到一定的修复作用。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明郭彩凤：起草文章，获取研究经费；谭燕：行政、技术或材料支持，支持性贡献；张岳峰：行政、技术或材料支持，指导，支持性贡献；周华荣：分析/解释数据；陈国华：采集数据；方雅秀：分析/解释数据；蓝晓凤：酝酿和设计试验，实施研究，对文章的知识性内容作批评性审阅，获取研究经费