基于纳米酶构建比色生物传感器用于总抗氧化能力分析

席书敏,王 丁,赵仁勇

河南工业大学 粮油食品学院,河南 郑州 450001

抗坏血酸(AA),又名维生素C,是一种能够清除体内过剩的活性氧以及维持氧化和抗氧化系统平衡的生物辅助因子和必需的抗氧化剂[1]。AA在生理和病理过程中起着不可或缺的作用,既能帮助预防坏血病、心血管疾病、过敏和炎症等复杂疾病,又能促进神经递质的形成、离子摄取和氨基酸代谢[2-3]。AA主要存在果蔬中,不能由机体直接合成。然而,食物中存在的抗氧化剂种类繁多且可能相互作用,难以对特定的抗氧化成分进行分析[4]。因此,总抗氧化能力(TAC)被用作评估抗氧化性能的重要指标。

目前,已有多种分析TAC的方法,主要包括1,1-二苯基-2-三硝基苯肼法(DPPH)[5]、氧化自由基吸收能力测定法(ORAC)[6]、铁离子还原抗氧化能力测定法(FRAP)[7]、等效抗氧化能力测定法(TEAC)[8]。这些方法不仅检出限较高,不利于实际应用,而且有的化学试剂具有刺激性对人体有害,有的方法所需仪器昂贵,对反应条件要求较高,操作难度大,还有的检测吸收波段重叠,结果有偏差。与这些方法相比,比色传感器通过溶液颜色的深浅或光学信号的变化确定待测物,具有可视化、操作简便、成本低、灵敏度和选择性高的优势。

纳米酶是具有类似天然酶催化活性的纳米材料,既具有纳米材料成本低廉、稳定性高、可回收利用和合成方法多样的性能优势,又具有很高的类酶催化活性[9-10]。自2007年具有过氧化物酶特性的Fe3O4纳米酶被报道以来[11],各种具有酶催化性能的纳米酶被研究,并在各个领域迅猛应用和发展[12]。纳米酶具有制备成本低且方法简单、稳定性好、催化性能可调等优点[13-14],是替代天然酶制备比色传感器应用于检测分析各种物质的良好替代品。

作者以2-甲基咪唑、硝酸锌、硝酸铁为原料,通过高温热解合成具有良好催化活性的铁-氮共掺杂碳基纳米酶(Fe-N/C)作为信号放大探针,结合显色机制,建立一种检测TAC的比色传感体系,进一步提高TAC的检测灵敏度。所制备的Fe-N/C纳米酶具有良好的类过氧化物酶催化活性和较强的底物亲和力,可用于模拟天然辣根过氧化物酶(HRP),而且在较宽的温度和pH值范围内表现出较高的活性。此外,AA可抑制Fe-N/C催化氧化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺显色反应的发生,在一定浓度范围内AA浓度与溶液的吸光度呈负相关关系,据此构建一种定量检测AA的新方法,并以AA为典型的抗氧化剂模型,通过加标回收试验验证该比色传感器在实际样品中分析TAC的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

硫酸镁、氯化钙、硫酸钾、葡萄糖(Glu)、抗坏血酸(AA)、谷胱甘肽(GSH)：分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司;果糖(Fru)、蔗糖(Suc)、2-甲基咪唑、3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)、对苯醌、L-组氨酸、乳糖(Lactose)、麦芽糖(Maltose)、L-半胱氨酸(L-Cys)：分析纯,上海麦克林有限公司;硝酸铁、硝酸锌、过氧化氢(H2O2)、氯化钠、甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)：分析纯,国药集团化学试剂有限公司;牛血清蛋白(BSA)：优级纯,Sigma-Aldrich公司。试验用水均为超纯水。

1.2 仪器与设备

PL1502-S分析天平：瑞士Mettler Toledo公司;HT7700透射电子显微镜(TEM)：日本Hitachi公司;UV-2550紫外-可见分光光度计：日本岛津企业管理有限公司;MINIFLEX600 X射线衍射仪(XRD)：日本Rigaku公司;SevenEasy S20 pH计：梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;Vortex-2 Genie漩涡振荡器：美国Scientific Industries公司。

1.3 试验方法

1.3.1 Fe-N/C纳米酶的制备

先将50 mg硝酸铁、1.68 g硝酸锌和3.7 g 2-甲基咪唑分散于160 mL甲醇溶液中,室温下将混合溶液搅拌约12 h,10 000 r/min离心10 min,用甲醇反复冲洗沉淀物,60 ℃过夜干燥即可得到Fe-ZIF8粉末。再将合成好的Fe-ZIF8粉末放在瓷舟中,在充满氮气氛围的高温管式炉中以10 ℃/min加热至900 ℃,并保温2.5 h,待管式炉冷却至室温后取出样品,即得到黑色粉末状的铁-氮共掺杂碳基(Fe-N/C)纳米酶。最后将制备的Fe-N/C纳米酶溶于超纯水并超声分散备用。

1.3.2 类过氧化物酶活性测试

以TMB为显色底物,对合成的Fe-N/C纳米酶的类过氧化物酶(POD)活性进行评价,具体步骤：在780 μL乙酸-乙酸钠缓冲液(100 mmol/L,pH 4.0)中,依次加入100 μL TMB(1 mmol/L)、100 μL H2O2(100 mmol/L)和20 μL Fe-N/C纳米酶(1 mg/mL),37 ℃孵育10 min后用紫外-可见分光光度计记录反应体系的吸光度。对照试验：将20 μL 1 mg/mL的Fe-N/C纳米酶替换为Fe-ZIF8纳米颗粒或者超纯水,检测过程与上述相同。

1.3.3 检测条件的优化

(1)pH值：先配制100 mmol/L不同pH值(2.5、3、3.5、4、4.5、5、6.5)的乙酸-乙酸钠缓冲液,加入1 mg/mL Fe-N/C纳米酶20 μL、100 mmol/L H2O2100 μL、1 mmol/L TMB 100 μL,总体积为1 mL。再将混合溶液在室温下孵育10 min,立即记录不同pH值溶液的吸光度,确定反应最适pH值。

(2)温度：将在最适pH值条件下的反应溶液分别置于不同的温度(5、25、30、37、40、50、60 ℃)下,其他检测过程同1.3.3(1)。

(3)Fe-N/C纳米酶浓度：在最适温度和pH值条件下设置Fe-N/C纳米酶的质量浓度为0.01、0.05、0.1、0.5、1、1.5、2 mg/mL,其他检测过程同1.3.3(1)。

1.3.4 酶促反应动力学研究

在780 μL乙酸-乙酸钠缓冲液(100 mmol/L,pH 4.0)中加入20 μL Fe-N/C纳米酶(1 mg/mL)、100 μL H2O2(100 mmol/L)和不同浓度的TMB,溶液混合后立即记录反应体系在最初60 s的动力学光谱。当以TMB为底物时,保持TMB浓度为1 mmol/L,改变H2O2的浓度,其他测试方法同上。根据底物浓度和反应初速度的倒数建立双倒数曲线图,计算最大反应速度和米氏常数。

v=ΔA/(Δt×ε×b);v=vmax×[S]/(Km+[S]),

式中：ΔA为反应体系的吸光度变化;v为初始反应速度,mol·L-1·s-1;Δt为反应时间的差值,s;ε为TMB的摩尔吸光系数(39 000 mol-1·L·cm-1);b为吸收层厚度,cm;vmax为最大反应速度,mol·L-1·s-1;[S]为底物浓度,mol/L;Km为Michaelis-Menten常数。

1.3.5 反应体系的催化机理验证

在乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 4.0,100 mmol/L)、100 μL TMB(1 mmol/L)、100 μL H2O2(100 mmol/L)、20 μL Fe-N/C纳米酶(1 mg/mL)体系中,分别加入50 μL不同的自由基清除剂,总体积为1 mL,37 ℃反应10 min后立即记录各个体系的吸收光谱。

1.3.6 比色法检测AA

在乙酸-乙酸钠缓冲液(100 mmol/L,pH 4.0)中,加入20 μL Fe-N/C纳米酶(1 mg/mL)、100 μL H2O2(100 mmol/L)、100 μL TMB(1 mmol/L)和不同浓度的AA,反应总体积为1 mL。37 ℃孵育10 min后记录波长652 nm处的吸光度,并建立AA浓度与吸光度的标准曲线。

1.3.7 总抗氧化能力分析

以AA为抗氧化剂的典型模型,对猕猴桃、橘汁、维生素C片的TAC进行分析。为使检测结果符合AA的线性范围,将样品用乙酸-乙酸钠缓冲液稀释一定倍数,并代替AA标准品加入体系中,其他测试条件参照1.3.6。样品的TAC含量均以mmol/L为单位。

1.4 数据处理与分析

所有试验至少进行3次,数据以平均值±标准差表示。采用SPSS 24对数据进行处理与分析,使用Origin 2023制图。

2 结果与分析

2.1 纳米酶的表征

由图1(a)可知,Fe-ZIF8呈现出表面光滑、分散性良好、尺寸均匀的菱形十二面体形貌。由图1(b)可知,经过高温热解后,由于有机配体在热解中发生向异性收缩,纳米材料皱缩且表面变得略微粗糙,但仍保持与Fe-ZIF8相同的形貌。图1(c)显示Fe-N/C纳米材料在2θ为25°、43°处有宽衍射峰,这两个特征峰对应于石墨的(002)和(100)特征峰,证明ZIF-8富含N的有机配体经过热解后形成N掺杂碳杂化物。锌基ZIF-8的特殊空腔结构可以掺入铁盐,900 ℃的热解使Zn元素从主体中挥发,从而扩大Fe原子之间的空间距离,防止原子聚集,并且会产生丰富的微孔结构,从而提供更多的催化活性位点。从图1(d)可以观察到,Fe-N/C纳米材料表面均匀分布C、N、Fe元素。以上结果表明Fe-N/C材料成功制备。

2.2 类过氧化物酶活性测试

以TMB为显色底物验证所制备的Fe-N/C纳米材料的类酶催化活性。如图2所示,TMB和TMB-H2O2溶液是无色的,且没有特征吸收峰。当加入Fe-N/C或Fe-ZIF8后,在H2O2存在下其能催化氧化TMB为蓝色产物,并在652 nm处有明显的吸收峰,证明Fe-N/C和Fe-ZIF8均有类过氧化物酶(POD)催化活性,但Fe-N/C的POD活性更强。这可能是由于在高温热解过程中,金属原子的扩散会形成缺陷结构,有利于活性位点与底物之间的电子转移[15]。同时,锌元素在高温下的蒸发使碳骨架形成均匀分布的孔,有利于活性位点的暴露和反应物的扩散,进而提升材料的催化活性[16]。

图2 Fe-N/C和Fe-ZIF8类过氧化物模拟酶的催化活性Fig.2 Catalytic activity of the peroxidase-like mimetic enzyme of Fe-N/C and Fe-ZIF8

与天然酶或其他催化剂一样,人工合成的纳米酶催化TMB氧化显色也受诸多因素影响。因此,本研究检测了反应体系在不同pH值、温度和Fe-N/C纳米酶浓度下的吸光度。如图3(a)所示,pH值对反应体系有显著影响,pH 4.0时吸光度最大。图3(b)为反应温度对Fe-N/C纳米酶催化TMB/H2O2氧化的影响,随着反应温度的逐渐升高,反应体系的吸光度先升高后下降,37 ℃时达到最大,高于37 ℃时吸光度开始下降,这是因为在较高温度下,反应体系中的H2O2不稳定易分解,导致TMB的氧化产物减少。由图3(c)可知,反应体系对Fe-N/C纳米酶质量浓度具有很强的依赖性,吸光度随着纳米酶质量浓度的升高逐渐增大,当质量浓度大于1 mg/mL后其增长速度开始减缓。考虑到合适的仪器响应范围,避免因质量浓度过高造成紫外光的散射,干扰检测结果,将1 mg/mL作为纳米酶的最优质量浓度。综上所述,选择pH 4.0、37 ℃、Fe-N/C纳米酶质量浓度1 mg/mL作为后续试验条件。如果纳米酶广泛地替代天然酶,除了具有优异的催化活性外,还需要有良好的稳定性和重复利用性。由图4可知,天然的辣根过氧化物酶(HRP)在第2次重复使用时,催化活性有很大程度的降低,重复使用性能较差,而Fe-N/C纳米酶循环使用5次之后,催化活性仍保持在80%以上,证明Fe-N/C纳米酶有良好的循环使用稳定性。

注：(a) pH值;(b) 温度;(c) Fe-N/C纳米酶质量浓度。图3 催化反应体系的条件优化Fig.3 Optimization of conditions for catalytic reaction systems

图4 Fe-N/C纳米酶和HRP的循环使用性能Fig.4 Recycling performance of Fe-N/C nanozyme and HRP

2.3 动力学测试

在最佳条件下,对具有POD活性的Fe-N/C纳米酶进行稳态动力学研究。如图5(a)、(c)所示,纳米酶的反应初速度随着底物浓度的增加而增加,一定浓度后达到平衡状态,符合典型的Michaelis-Menten方程模型。以反应初速度的倒数和底物浓度的倒数绘制Lineweaver-Burk图(图5(b)、(d)),双倒数曲线有着良好的正相关线性关系,显示出Fe-N/C纳米酶稳态动力学的变化趋势。根据双倒数曲线的截距和斜率,可求出Fe-N/C纳米酶对TMB和H2O2的vmax和Km。Km代表酶与底物的亲和能力,Km越小,对底物的亲和力越强,Km越大,亲和能力越弱[17]。由表1可知,Fe-N/C纳米酶对底物TMB、H2O2的Km均低于HRP,同时也低于大多数已报道的纳米酶,表明该纳米酶对底物有较高的亲和力,在较低的底物浓度下即可达到最大催化速度,有利于反应的进行。并且,该纳米酶的参数vmax表明,Fe-N/C作为POD酶具有相对较好的催化活性,可以作为人工模拟酶代替天然酶。

表1 各种催化剂的动力学参数比较Table 1 Comparison of kinetic parameters of various catalysts

注：(a) TMB浓度对反应速度的影响;(b) TMB浓度与反应初速度的双倒数曲线;(c) H2O2浓度对反应速度的影响;(d) H2O2浓度与反应初速度的双倒数曲线。图5 Fe-N/C纳米酶的酶促反应动力学Fig.5 Kinetics of the enzymatic reaction of Fe-N/C nanozymes

2.4 催化机理验证

一般来说,POD模拟酶的催化途径可分为活性氧(ROS)的产生和电子转移过程[23]。纳米酶催化产生ROS,如羟基自由基(·OH)、单线态氧(1O2)、超氧阴离子(O2·-)等,催化氧化显色底物是溶液颜色变化的主要原因。因此,本研究选择硫脲、对苯醌和L-组氨酸分别作为·OH、O2·-和1O2的自由基清除剂,探索Fe-N/C-H2O2-TMB体系中可能存在的ROS,从而研究Fe-N/C作为类过氧化物酶的催化机理。如图6(a)所示,L-组氨酸对体系几乎没有影响。而加入对苯醌和硫脲之后,反应体系的吸光度显著降低,表明催化过程形成了·OH和O2·-。为进一步验证·OH的生成,选用对苯二甲酸作为·OH的荧光探针。对苯二甲酸本身没有荧光性质,但和·OH结合生成的2-羟基对苯二甲酸具有强荧光[24]。从图6(b)可以明显观察到,反应体系在波长430 nm左右有明显的荧光峰,并且荧光强度随Fe-N/C纳米酶质量浓度的增大而升高,再次证明·OH参与了反应体系的催化氧化。以上现象表明,Fe-N/C能够催化氧化底物生成强氧化性的ROS,进而氧化TMB生成蓝色产物,从而表现出良好的催化活性,并且·OH在Fe-N/C类过氧化物酶催化反应中起到关键作用。

图6 Fe-N/C的类过氧化物酶机理研究Fig.6 Peroxidase-like mechanism study of the Fe-N/C

2.5 AA的比色检测

AA是一种广泛使用的抗氧化剂,能与溶液中的自由基发生反应,导致催化氧化过程被还原,对应的蓝色产物oxTMB减少。从图7(a)可以看出,当反应体系中没有AA时,体系在652 nm处的吸光度最高,当AA加入时,吸光度随AA浓度的升高不断降低,而且溶液也由蓝色变为无色,证明该比色传感平台应用于AA检测具有良好的可行性。在AA为0.1～160 μmol/L范围内,AA浓度与吸光度呈良好的负相关关系,线性回归方程为y=-0.003 34x+0.587 49(R2=0.997 2),检出限为0.03 μmol/L(S/N=3)(图7(b))。由表2可知,本检测方法展现出较宽的线性范围和较低的检出限,优于其他的检测体系。

表2 不同方法检测AA的比较Table 2 Comparison of different methods for detecting AA μmol/L

图7 基于Fe-N/C纳米酶的比色传感体系检测AAFig.7 Detection of AA by a colorimetric sensor system based on Fe-N/C nanozyme

选取实际样品中可能存在的干扰物质来评估该传感器的选择性能。如图8所示,当加入与AA浓度相同的抗氧化剂GSH和L-Cys时均引起体系吸光度的降低,然而当分别加入100倍AA浓度的其他干扰物质时,这些干扰物质对体系几乎没有影响,由此可知,该比色传感平台对还原性物质的性能检测具有较强的特异性,可以用来检测TAC。

图8 AA比色检测体系的选择性Fig.8 Selectivity of AA colorimetric detection systems

2.6 总抗氧化能力的测定

为了进一步验证该方法的可行性和准确性,对实际样品的TAC(以AA含量计算)进行检测分析。橘汁、猕猴桃和维生素C片的TAC含量分别为42、60、68 μmol/L,维生素C片的抗氧化能力高于橘汁和猕猴桃,且该检测结果与配料表成分含量一致。通过在稀释样品(1%)中添加不同浓度AA进行加标回收试验,如表3所示,回收率为92.69%～105.45%,相对标准偏差(RSD)小于2%,表明该方法具有较高的准确性和良好的应用潜力,适用于复杂样品的TAC检测。

表3 稀释样品中AA的回收试验Table 3 Recovery experiments for AA in diluted samples

3 结论

通过高温热解法成功制备了具有较高催化活性的Fe-N/C纳米酶,并构建了一种简便快捷、准确度高、特异性好的检测AA和TAC比色新方法。Fe-N/C纳米酶具有良好的类过氧化物酶催化活性,能够在H2O2存在下催化产生多种ROS,进而氧化TMB产生蓝色氧化产物。在最适条件下,Fe-N/C纳米酶的催化过程符合Michaelis-Menten方程模型,对底物TMB和H2O2的亲和力均高于HRP,有利于反应的进行。最终构建的AA比色传感平台在0.1～160 μmol/L范围内与吸光度呈线性关系(R2=0.997 2),检出限低至0.03 μmol/L。同时,该传感器有较强的抗干扰性能,在分析实际样品中TAC时,表现出良好的回收率和灵敏度。Fe-N/C纳米酶在分析TAC中展现出良好的应用潜力,后续需进一步研究纳米酶的比活性、材料的耐储存稳定性以及体系对其他抗氧化剂的检测范围,继续构建基于纳米酶的新型比色传感器应用于其他目标物的检测分析。