一株不动杆菌JBX-006对聚丙烯酰胺的降解特性研究*

王 睿 朱子恒 舒文明 余维初 孙文秀#

(1.长江大学生命科学学院,湖北 荆州 434025;2.长江大学化学与环境工程学院,湖北 荆州 434025)

聚丙烯酰胺(PAM)是一种线型水溶性高分子聚合物,是丙烯酰胺均聚物与共聚物的统称,溶于水后具增稠性、减阻性、增黏性、助留性等性能,被广泛应用在石油开采、水处理、纺织和造纸等领域[1-4]。研究表明,PAM在油田生产提高开采率后大量残存于废弃的采出液中,排放入土壤环境后会缓慢降解为丙烯酰胺,进而改变地下水的理化性质,对人和动物的大脑造成毒害作用[5-6]。然而,如何高效降解PAM仍是目前亟需解决的问题。

近年,PAM污染土壤的修复主要采用化学降解法[7]。化学降解法能够将大部分PAM降解成小分子有机物,但投资和运行成本较高,易造成二次污染[8-9]。生物降解因其无污染、低成本的特点成了聚合物无害化处理的新途径,受到了很多研究者的关注[10-11]。因此,从不同环境中分离微生物来降解PAM也就成了该领域的研究热点[12]。从含PAM的废水及污泥中分离到的芽孢杆菌(Bacillussp.)[13]72,[14]、克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)[15]、梭菌(Clostridiumbifermentans)[16]等可以在一定程度上降解PAM,但降解率不高。改变培养时的营养条件等可以促进微生物对PAM的降解[17-18]。夏彦渊等[19]发现优化碳源、氮源、培养温度后,混合菌对PAM的降解率明显提高,可达到32.6%。李淑芹等[20]发现在以PAM为唯一碳氮源条件下,优化培养温度和初始pH可以提高枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)对PAM的降解率,最高降解率可达45.04%。但实际上上述研究中的微生物降解PAM的效率仍然偏低,难以在实际应用中达到长效修复的目的。有研究发现,金属离子可以与PAM链上的羧酸根阴离子发生静电相互作用,也可以与水中溶解氧共同作用断裂PAM骨架,从而使PAM降解[21],这为进一步提高微生物对PAM的降解率提供了新的思路。

因此,本研究从大庆油田周边土壤样品中分离出1株PAM降解效果最好的细菌,采用单因素和正交试验分析了外碳源、外氮源、金属离子等因素对其降解PAM的影响,弄清其降解特性,以期为提高微生物降解PAM提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌种来源

菌种分离自大庆油田周边土壤。

1.1.2 培养基

富集培养基:酵母粉5.00 g/L,胰蛋白胨10 g/L,NaCl 10.0 g/L,调pH为7。

驯化培养基:一定浓度的PAM,酵母粉0.05 g/L,NaCl 0.5 g/L,K2HPO41.0 g/L,MgSO40.1 g/L,调pH为7。

基础培养基:PAM 300 mg/L,NaCl 5.0 g/L,K2HPO40.5 g/L,KH2PO40.5 g/L,MgSO40.1 g/L,调pH为7。

营养培养基:PAM 300 mg/L,酵母粉5.00 g/L,胰蛋白胨10.0 g/L,NaCl 10.0 g/L,琼脂15 g/L,调pH为7。

牛肉膏蛋白胨固体培养基:牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5.0 g/L、琼脂15 g/L,调pH为7。不加琼脂则为牛肉膏蛋白胨液体培养基。

1.2 方 法

1.2.1 PAM降解菌的分离、富集和驯化

称取3 g土壤接种于100 mL富集培养基中,在30 ℃、140 r/min的振荡条件下培养48 h得到富集菌液。取5 mL富集菌液接种于100 mL含0.6 g/L PAM的驯化培养基中,同样在30 ℃、140 r/min的振荡条件下培养7 d,再取5 mL驯化液依次转接到含0.9、1.2、1.5、1.8、2.0 g/L PAM驯化培养基中,逐级驯化培养。取最终驯化液1 mL涂布在营养培养基上,30 ℃下倒置培养24 h。挑取平板上不同菌落在牛肉膏蛋白胨固体培养基中进行划线培养,将纯化的单菌落接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中,30 ℃培养24 h,加入与菌液体积相同的30%(质量分数)无菌甘油,分装至菌种保存管(1 mL/管),-80 ℃保存备用。

1.2.2 测定并计算PAM降解率

采用淀粉-碘化镉分光光度法[22]测定PAM并计算降解率。

1.2.3 PAM降解菌的形态学与生理生化鉴定

将分离得到的单菌落接种到牛肉膏蛋白胨固体培养基上30 ℃恒温培养24 h后,观察菌落的大小、形状等特征[23]。同时,把上述分离得到的单菌制备成涂片标本,经革兰氏染色后观察细菌形态;进行葡萄糖产酸、H2S产生、柠檬酸盐利用、淀粉利用、硝酸盐还原实验、VP实验、吲哚实验、甲基红实验、明胶利用、蔗糖利用、鼠李糖利用等生理生化鉴定[24]。

1.2.4 PAM降解菌的分子生物学鉴定

采用TIANGEN细菌基因组脱氧核糖核酸(DNA)试剂盒提取供试菌株的DNA,利用通用引物16F(5’-AGAGTTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和16R(5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)对细菌的16S rDNA进行聚合酶链式反应(PCR)扩增,扩增体系(50 μL):2×Taq PCR Master Mix 25 μL,引物16F和16R(10 μmol/L)各2 μL,模板DNA 2 μL,双蒸水19 μL;扩增条件:95 ℃预变性5 min后,95 ℃变性30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,34个循环,再72 ℃延伸10 min。通过琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像检测条带大小,扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,所得结果经美国国家生物信息中心(NCBI)数据库比对后,挑选相关序列,在MEGA 7.0软件中采用邻近法构建系统发育树。

1.2.5 不同外碳源对降解PAM的影响

以营养培养基中酵母粉的浓度为参考,分别在基础培养基中加入5 g/L葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖、乙酸钠作为外碳源,并以原基础培养基作为对照。准确量取50 mL上述基础培养基置于150 mL锥形瓶中,接种2%(体积分数,下同)菌液后置于30 ℃、140 r/min摇床中振荡培养5 d,测定PAM并计算降解率。

1.2.6 不同外氮源对降解PAM的影响

以营养培养基中胰蛋白胨的浓度为参考,分别在基础培养基中加入10.0 g/L脲、硝酸钾、酵母粉、蛋白胨、氯化铵作为外氮源,并以原基础培养基作为对照。准确量取50 mL上述基础培养基置于150 mL锥形瓶中,接种2%菌液后置于30 ℃、140 r/min摇床中振荡培养5 d,测定PAM并计算降解率。

1.2.7 金属离子对降解PAM的影响

以不加金属离子的基础培养基为对照,分别在基础培养基中添加Fe3+、Mn2+、Fe2+、Cu2+(金属离子质量浓度均为30 mg/L[25]115)。准确量取50 mL上述基础培养基置于150 mL锥形瓶中,接种2%菌液后置于30 ℃、140 r/min摇床中振荡培养5 d,测定PAM并计算降解率。

1.2.8 单因素试验初步探究外碳源、外氮源和金属离子的量

准确量取50 mL基础培养基置于150 mL锥形瓶中,接种2%菌液后分别加入1、3、5、7、9 g/L的最优外碳源,置于30 ℃、140 r/min摇床中振荡培养5 d,研究影响降解PAM的最优外碳源量。同样的方法考察不同最优外氮源、最优金属离子的量,最优外氮源考察了2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 g/L,最优金属离子考察了10、20、30、40、50 mg/L。

1.2.9 正交试验确认外碳源、外氮源和金属离子的量

在单因素试验初步确定外碳源蔗糖、外氮源硝酸钾和金属离子Fe2+的量基础上,采用正交试验设计进一步确认它们的量。正交试验的因素和水平设计如表1所示。

表1 正交试验因素和水平

2 结果与分析

2.1 PAM降解菌的分离与鉴定

从大庆油田周边土壤中分离到11株PAM降解菌,分别命名为JBX-001～JBX-011,它们的原始PAM降解率依次为29.59%、22.66%、33.78%、21.64%、40.56%、42.24%、39.30%、28.62%、23.08%、29.93%、28.03%,可见JBX-006的原始PAM降解率最高,因此以JBX-006为PAM优势降解菌,因此对JBX-006进一步富集和驯化。

通过牛肉膏蛋白胨固体培养基培养观察发现,JBX-006菌落呈圆形,大小2～3 mm,表面湿润有隆起,菌落淡黄,不透明,边缘光滑平整。

生理生化鉴定表明,JBX-006的革兰氏染色、葡萄糖产酸、H2S产生、硝酸盐还原实验、VP实验、吲哚实验、甲基红实验均为阴性,能够利用柠檬酸盐和淀粉,不能利用明胶、蔗糖和鼠李糖。由菌落形态学与菌株生理生化鉴定结果可初步判定JBX-006为不动杆菌属(Acinetobacter)。

琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像检测发现,在1 500 bp左右有一特异性条带。测序结果表明,菌株JBX-006的16S rDNA长度为1 493 bp,经NCBI 数据库比对,与不动杆菌属的相似度达到99%。采用邻近法构建系统发育树(见图1),JBX-006与不动杆菌属聚为一类,根据距离可确定为琼氏不动杆菌(Acinetobacterjunii)。该菌在30 ℃、pH 7.0左右时,7 d可对水体中十六烷烃降解率高达75%[26]。

图1 JBX-006的系统发育树

2.2 PAM优势降解菌JBX-006的降解特性

2.2.1 外碳源对不动杆菌JBX-006降解PAM的影响

碳是构成生物体的必需元素,碳源是影响PAM降解菌生长和降解性能的重要营养物质。PAM是高分子有机物,微生物利用外碳源才能更好地释放特定酶使PAM酰胺键断裂,变为小分子物质[27]。从图2可以看出,不同外碳源会影响JBX-006对PAM的降解效果。加入蔗糖、可溶性淀粉和乙酸钠可以提高JBX-006对PAM的降解率,降解率分别为70.66%、59.17%、44.41%,比对照分别增加27.54、16.07、1.30百分点,而加入葡萄糖和乳糖后,JBX-006对PAM的降解率反而降低,因此蔗糖可作为最优外碳源。

图2 不同外碳源对PAM降解的影响

2.2.2 外氮源对不动杆菌JBX-006降解PAM的影响

氮亦是构成生物体的必需元素,氮源影响着PAM降解菌的生长和降解性能。有研究发现,当含有PAM的环境中添加外氮源后,微生物会利用添加的外氮源快速生长,释放酰胺酶切断PAM的酰胺键,然后再利用由此产生的氮源大量繁殖,加快降解PAM的速度[28]。从图3可以看出,不同氮源也会影响JBX-006对PAM的降解效果。加入硝酸钾可以提高JBX-006对PAM的降解率,降解率为52.18%,比对照增加9.08百分点,但加入脲、蛋白胨、酵母粉、氯化铵后,JBX-006对PAM的降解率降低。因此,硝酸钾为最优外氮源。

图3 不同外氮源对PAM降解的影响

2.2.3 金属离子对不动杆菌JBX-006降解PAM的影响

金属离子是影响微生物降解PAM的一个重要因素,特别是无机盐可为微生物机体提供生命活动必需的无机离子,起到参与酶合成、调节渗透压平衡等作用[25]117。由图4可知,不同的金属离子对PAM降解有较大影响。加入Cu2+、Mn2+、Fe3+后,JBX-006对PAM的降解率降低,这可能是因为金属离子与PAM发生化学交联,形成不溶的聚合物胶团,使得JBX-006不能很好地利用PAM。但是,Fe2+可以促进JBX-006降解PAM,使PAM降解率相比对照提高25.08百分点,这与卞立红等[25]116报道的研究结果基本一致。由此确定Fe2+为最优金属离子。

图4 不同金属离子对PAM降解的影响

2.2.4 单因素试验结果

由图5可见,在试验范围内,当基础培养基中加入不同浓度的蔗糖、硝酸钾和Fe2+时,JBX-006对PAM的降解率均呈先升高后降低的趋势,可以发现最优蔗糖添加量为5 g/L、最优硝酸钾添加量为10.0 g/L、最优Fe2+添加量为30 mg/L。

图5 蔗糖、硝酸钾、Fe2+添加量对PAM降解的影响

2.2.5 正交试验结果

JBX-006降解PAM的正交试验结果见表2,通过极差分析发现,蔗糖的影响最大,Fe2+的影响最小,蔗糖、硝酸钾、Fe2+的最优添加量分别为5 g/L、10.0 g/L、30 mg/L,与单因素试验结果一致。在正交试验得到的最佳条件下,验证发现,JBX-006对PAM的降解率可达81.65%,远高于对照,也高于前人报道的不同细菌对PAM的降解率[13]74。

表2 正交试验结果

3 结 论

在大庆油田周边土壤中富集、驯化、分离获得1株可高效降解PAM的优势菌JBX-006,经形态学、生理生化和分子生物学鉴定为琼氏不动杆菌。该菌株生长的最优外碳源、最优外氮源和最优金属离子分别是蔗糖、硝酸钾和Fe2+,在5 g/L蔗糖、10.0 g/L硝酸钾、30 mg/L Fe2+的最优条件下,30 ℃培养5 d对300 mg/L的PAM的降解率可达81.65%。