银川地区肉牛子宫内膜炎病原菌的分离鉴定与药敏试验

岳 康,郭延生,刘红燕,,郭亚男,王建东*

(1.宁夏农林科学院动物科学研究所,宁夏银川 750002;2.宁夏大学农学院,宁夏银川 750021)

牛子宫内膜炎是一种繁殖障碍性疾病,不仅导致母牛不易受孕、容易流产和产犊时间间隔延长[1],还会增加养殖成本[2]。我国牛子宫内膜炎的发病率约为20%～50%[3],并且60%～90%会引发不孕症[4-5]。美国每年因不孕症或繁殖疾病淘汰近12.19%的奶牛,子宫内膜炎发病率达53%,占淘汰牛总数的52.37%[4]。此外,英国报导不孕牛中约95%是由子宫内膜炎引起的[5]。

关于肉牛子宫内膜炎的报道很少。宁夏适于肉牛的养殖,但随着肉牛养殖规模不断扩大以及饲养管理水平低下等因素,肉牛子宫内膜炎的发病率在不断上升,导致肉牛繁殖力低下,给宁夏肉牛养殖业带来了严重的经济损失,阻碍其健康发展。

本试验对引起银川地区肉牛子宫内膜炎的病原菌进行分离鉴定,并对分离出来的病原菌进行药物敏感性试验,旨在说明银川地区肉牛子宫内膜炎的感染情况,为合理治疗肉牛子宫内膜炎提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 试验菌株从银川地区肉牛养殖场及散户中采集的50份患子宫内膜炎的肉牛子宫分泌物中分离获得。

1.1.2 主要试剂 无菌脱纤维羊血,购自广州鸿泉生物科技有限公司;哥伦比亚血琼脂基础,购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司;水解酪蛋白琼脂(MHA)培养基,水解酪蛋白肉汤(MHB)培养基,各种生化制剂及药敏片,购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.1.3 主要仪器 小型高速离心机(Eppendorf Centrifuge 5424),Eppendorf中国有限公司产品;电泳仪(DYY-6C),北京六一生物科技有限公司产品;PCR仪(T100 Thermal Cycler),胶成像系统(Universal Hood Ⅱ),Bio-Rad公司产品。

1.2 方法

1.2.1 病料采集 2022年2～8月在银川地区肉牛养殖场及散户中选取50例临床确诊为患子宫内膜炎的肉牛。将病牛固定,对病牛进行排粪刺激使其排粪,待粪排干净后,用清水清洗病牛外阴部,再用0.1%的新洁尔灭消毒。采用人工受精的方法,用无菌输精枪抽取子宫分泌物3 mL放入准备好的无菌管中,立即置于液氮罐中保存,随后尽快送往实验进行病原菌的分离鉴定。

1.2.2 病原菌分离鉴定 将采集的病牛子宫分泌物分别划线接种于血平板上,需氧培养放置37℃恒温培养箱培养18～24 h,厌氧培养先将血平板装入含有厌氧产气包的厌氧袋中,放置于二氧化碳培养箱中培养18～24 h。观察菌落形态特征,挑取单一菌落至MHB培养基中培养16～24 h,进一步将培养的菌液接种于血平板上进行分离培养,连续纯化3代。将每代培养好的菌株用16S rRNA通用引物[6]扩增,扩增产物送至上海生工生物工程有限公司测序,结果与GenBank中已提交的菌株序列进行比对鉴定。

1.2.3 药敏试验 采用药敏纸片琼脂扩散法,即Kirby-Barer法[7-8],对分离出的菌株进行药敏实验。将分离菌株均匀涂抹在MHA平板上,然后将药敏片贴于平板表面,将放有药敏纸片的平皿置于37℃恒温培养24 h,使用游标卡尺对抑菌圈直径进行测量并记录。药敏结果对照美国临床实验室标准化协会(CLSI)推荐的的判定标准进行判定[9-10],结果用耐药(resistence)、敏感(sensitive)及中介(intermediate)表示。

2 结果

2.1 病原菌分离鉴定结果

本试验从50份子宫分泌物中总计分离获得89株细菌,主要病原菌为大肠埃希氏菌、链球菌、金黄色葡萄球菌以及蜡样芽孢杆菌和产气荚膜梭菌。其中,大肠埃希氏菌32株,检出率为36%,链球菌25株,检出率为28%,金黄色葡萄球菌17株,检出率为19%,蜡状芽孢杆菌9株,检出率为10%,产气夹膜梭菌6株,检出率为7%。结果见表1。

表1 样本菌株分离概况Table 1 Sample strain isolation overview

对所有分离到的菌株培养纯化后,提核酸用16S rRNA通用引物进行PCR扩增鉴定。

结果显示通用引物能成功扩增所有菌株的16S rRNA序列,各菌株序列长度约为1.4～1.5 kb(图1)。各菌株16S rRNA序列比对发现,其与NCBI上已公布的菌株序列同源性均大于98%。

M.DNA标准DL 2 000;1～3.大肠埃希氏菌;4～6.链球菌;7～9.金黄色葡萄球菌;10～12.蜡样芽孢杆菌;13～15.产气荚膜梭菌M.DNA Marker DL 2 000;1-3.Escherichia coli;4-6.Streptococcus;7-9.Staphylococcusaureus;10-12.Baccillus cereus;13-15.Clostridiumaerosola gas图1 部分菌株PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification results of some strains

2.2 药敏试验结果

2.2.1 大肠埃希氏菌药敏试验结果 32株大肠埃希氏菌对19种抗菌药物的药敏试验结果见表2,分离的大肠埃希氏菌对恩诺沙星、利奈唑胺药物的耐药率均超过70%;对红霉素、卡那霉素、磺胺嘧啶、氟苯尼考的耐药率达50%～70%;对头孢唑啉、米诺环素、头孢他啶高度敏感,耐药率在10%以下;对哌拉西林完全敏感。

表2 大肠埃希氏菌药敏试验Table 2 Drug susceptibility test of Escherichia coli

2.2.2 链球菌药敏试验结果 25株链球菌对19种抗菌药物的药敏试验结果见表3,分离的链球菌对庆大霉素、氨苄西林、青霉素药物的耐药率均超过80%;对阿米卡星、恩诺沙星、四环素、头孢唑啉、克林霉素、链霉素、林可霉素、卡那霉素、氟苯尼考的耐药率在50%～70%;对左氧氟沙星、头孢曲松钠较为敏感,耐药率为20%。

表3 链球菌药敏试验Table 3 Drug susceptibility test of Streptococcus

2.2.3 金黄色葡萄球菌药敏试验结果 17株金黄色葡萄球菌对15种抗菌药物的药敏试验结果见表4,分离的金黄色葡萄球菌对庆大霉素、林可霉素、青霉素药物的耐药率均超过70%;对头孢唑啉、卡那霉素的耐药率为50%～70%;对万古霉素完全敏感。

表4 金黄色葡萄球菌药敏试验Table 4 Drug susceptibility test of Staphylococcus aureus

2.2.4 蜡样芽孢杆菌药敏试验结果 9株蜡样芽孢杆菌对14抗菌药物的药敏试验结果见表5,分离的蜡样芽孢杆菌对庆大的耐药率达78%;对四环素、林可、磺胺嘧啶、氟苯尼考的耐药率为50%～70%;对头孢唑啉、氟苯尼考较为敏感,耐药率为22%以下,对于米诺环素完全敏感。

表5 蜡样芽孢杆菌药敏试验Table 5 Drug susceptibility test of Bacillus cereus

2.2.5 产气荚膜梭菌药敏试验结果 6株产气荚膜梭菌对14抗菌药物的药敏试验结果见表6,分离的产气荚膜梭菌对庆大霉素、林可霉素、卡那霉素、青霉素的耐药率最高达83%以上;对阿米卡星、头孢唑啉、头孢他啶、链霉素、红霉素的耐药率在50～67%;对恩诺沙星、磺胺嘧啶的耐药率为33%;对四环素、氟苯尼考较为敏感,耐药率为17%;对于头孢噻肟高度敏感。

表6 产气荚膜梭菌药敏试验Table 6 Drug susceptibility test of Clostridium perfringens

3 讨论

本试验对银川地区收集到的50份患子宫内膜炎的肉牛子宫分泌物进行病原菌分离鉴定,结果发现引起银川地区肉牛子宫内膜炎的主要病原菌为大肠埃希氏菌(36%)、链球菌(28%)、金黄色葡萄球菌(19%)、蜡样芽孢杆菌(10%)以及产气荚膜梭菌(7%)。赵红霞等[11]报道引起内蒙古地区奶牛子宫内膜炎的病原菌为大肠埃希氏菌(48.4%)、金黄色葡萄球菌(20.4%)、链球菌(32.3%)以及沙门氏菌(8.1%),且大肠埃希氏菌和链球菌的占比高于其他病原菌,与本试验结果基本一致。李蕊等[12]报道引起保定市奶牛子宫内膜炎的病原菌有链球菌、葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、大肠埃希氏菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌和棒状杆菌,这与本试验及戴浩楠[13]、张维军[14]等人的报道结果有所不同,这可能与地域差异、饲养条件以及牛品种不同有关。

药敏试验结果显示,5种分离得到的病原菌对24种药品产生了不同程度的耐药性。分离出的大肠埃希菌对头孢唑啉、米诺环素、头孢他啶高度敏感。链球菌对左氧氟沙星、头孢曲松钠较为敏感。金黄色葡萄球菌对万古霉素100%敏感,这与王桂琴等[15]报道的完全一致。蜡样芽孢杆菌对头孢唑啉、链霉素、米诺环素敏感。分离的大肠埃希氏菌和蜡样芽孢杆菌对林可霉素,氨苄西林的敏感度都不高。这与李明[16]的研究结果结果基本一致。说明牛场在对于牛子宫内膜炎的治疗过程中,没有合理的进行药物的选择和更替,从而导致常用药物在病牛体内产生了耐药性。病原菌对头孢类药物都表现为不耐或者中耐,几乎没有特别强的耐药性,与龚团莲[17]的研究结果相同。

本研究中青霉素、庆大霉素、林可霉素、以及四环素的药物敏感性结果较差,这可能与牛场长期使用这些药物且不用相似药效的药物而使病牛产生耐药性有关。因抗生素残留问题,各国都已经规范和限制抗生素的使用。为了避免耐药菌株的产生,应规范合理选用抗菌药物,定期对反复患病的动物进行药物敏感性检测。对于已经耐药的病原菌,用药时应该合理替换药物,避免耐药菌株的产生。近年来,关于中药治疗子宫内膜炎的成功病例有很多,可以参考中药治疗[18],或者中西结合的方式治疗。

综上所述,本试验中银川地区肉牛子宫内膜炎的病原菌主要为大肠埃希氏菌、链球菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌以及产气荚膜梭菌。分离出的89株病原菌对常用24种抗菌药物均存在不同程度的耐药情况,仅对少数药物敏感,可以为规范治疗肉牛子宫内膜炎的用药提供一定的指导。