H5亚型禽流感病毒HA蛋白在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达与纯化

刘郁夫,陈晓洁,区炳明,容 芳,郝文茜,4,陈瑞爱2,,4*

(1.肇庆学院生命科学学院,广东肇庆 526060;2.华农(肇庆)生物产业技术研究院有限公司,广东肇庆 526238;3.岭南现代农业科学与技术广东省实验室肇庆分中心,广东肇庆 526238;4.华南农业大学兽医学院,广东广州 510642)

H5亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)是一种重要的禽类动物疫病病原,以高发病率、高致死率、传播速度快、病毒变异快为主要特点[1]。H5亚型AIV每年给我国养禽业造成巨大经济损失,是我国一类动物疫病,属于国家强制免疫范畴。目前我国针对H5亚型AIV的防控主要依赖灭活疫苗免疫[2],但H5亚型AIV可感染人,具有重要的公共卫生意义,因此H5亚型AIV传统鸡胚苗的生产还需要生物安全三级车间,并且生产的AIV病毒液中含有大量鸡胚杂蛋白,不利于病毒液进一步的浓缩纯化。探索AIV新型亚单位疫苗的生产制备方法,具有良好的应用前景[3-4]。

AIV属于正黏病毒科A型流感病毒属成员,基因组由8条分节段的RNA组成,至少编码11种病毒蛋白,根据病毒表面的糖蛋白血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)可将AIV分为不同的亚型[5-6]。其中HA是AIV主要的免疫原性蛋白,试验表明SPF鸡体内HA抗体水平越高,抵抗同源AIV攻毒的保护率越高[6-7]。

此前国内外已有多篇文献报道通过各种方法制备AIV HA蛋白,如大肠埃希氏菌原核表达系统[8]、杆状病毒昆虫细胞表达系统[9]、病毒活载体系统[10]等,其中杆状病毒-昆虫细胞系统表达的蛋白因具有一定糖基化修饰、蛋白产量高、表达成本低、便于放大悬浮生产等优点而研究较多。本试验以H5亚型AIV国内流行分支clade 2.3.4.4d的HA基因为靶基因,通过杆状病毒-昆虫细胞表达系统进行表达,并利用Strep-tag亲和层析纯化重组蛋白,以提高HA蛋白纯度和回收率,保持HA蛋白的生物活性。本试验可为H5亚型AIV新型疫苗研发、HA单克隆抗体制备及后续研究奠定前期基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒和细胞 pFastBac1质粒、Sf9昆虫细胞,由岭南现代农业科学与技术广东省实验室肇庆分中心保存。DH5α感受态细胞(C1100),DH10BAC感受态细胞(C1480),北京索莱宝科技有限公司产品。

1.1.2 主要试剂 H5亚型AIV鸡阳性血清(Re-11株),由肇庆大华农生物药品有限公司提供;PrimeSTAR GXL DNA聚合酶(R050A),BamHⅠ限制性内切酶(1605),HindⅢ限制性内切酶(1615),宝日医生物科技(北京)有限公司产品;质粒小量提取试剂盒(D6943),胶回收试剂盒(D2500),BAC/PAC DNA小量提取试剂盒(D2156),OMEGA公司产品;青链霉素混合液(P1400),Anti-Strep鼠源单抗(K200012M),FITC标记的羊抗鼠二抗(SF131),FITC标记的兔抗鸡二抗(K1035R-FITC),羊抗鼠酶标二抗(SE131),兔抗鸡酶标二抗(SE235),Strep琼脂糖树脂(YA2500),北京索莱宝科技有限公司产品;胎牛血清(31985088),Sf-900 Ⅲ昆虫细胞培养基(12658035),脂质体转染试剂Cellfectin Ⅱ(10362100),Opti-MEM减血清培养基(31985088),Gibco公司产品;SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A),硝酸纤维素膜(FFN02),BeyoECL Plus(P0018S),上海碧云天生物技术有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 PCR仪(C1000-48/48),伯乐生命医学产品(上海)有限公司产品;超微量分光光度计(nanodrop one),生物安全柜(1389),倒置荧光成像系统(EVOS M5000),赛默飞世尔(苏州)仪器有限公司产品;倒置显微镜(DMI1),德国徕卡显微系统公司产品;全能型成像仪(AI800),美国通用电气公司产品;生化培养箱(LRH-250),上海一恒科学仪器有限公司;凝胶成像仪(2500B),上海天能生命科学有限公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因设计与合成 从NCBI网站上下载H5亚型禽流感病毒中国流行株A/duck/China/1033/2017(H5N1)(clade 2.3.4.4d)的HA蛋白序列(MK554842),在HA基因的起始密码子之前设计Kozac序列和BamHⅠ酶切位点,并将HA的血凝素信号肽序列替换成蜂毒素信号肽序列(MKFLVNVALVFMVVYISYIYA),在肽链C端设计Strep-tag Ⅱ小分子标签(WSHPQFEK)和HindⅢ酶切位点,基因序列由苏州金唯智生物科技有限公司进行密码子优化和合成。

1.2.2 重组杆状病毒质粒Bacmid-HA的构建 使用BamHⅠ和HindⅢ双酶切,将目的基因HA克隆至杆状病毒穿梭质粒中pFastBac1,转化至DH5α感受态细胞中,PCR鉴定正确的单菌落送苏州金唯智生物科技有限公司进行测序验证,序列完全没有突变的质粒命名为pFastBac-HA。HA基因的PCR鉴定引物序列HA-F:AAATCGCCACCAGAAGTAAGA,HA-R:CTGCGTTGTAAGTCCAGAC- G,扩增的目的片段大小约642 bp。

根据说明书构建重组杆状病毒质粒Bacmid-HA,向刚化冻的DH10Bac感受态细胞中加入杆状病毒供体质粒pFastBac-HA 10 ng,于冰上静置30 min后,置于42℃水浴锅热击90 s,之后向感受态细胞加入900 μL SOC培养基(不含抗生素),并置于37℃摇床振荡培养4 h,取50 μL菌液涂布于抗性LB平板中。平板中含卡那霉素50 μg/mL、四环素10 μg/mL、庆大霉素7 μg/mL、IPTG 125 μg/mL、X-gal 100 μg/mL,37℃温箱培养20 h后挑选白色单菌落进行PCR鉴定。

根据BAC/PAC DNA小量提取试剂盒(D2156)说明书抽提重组HA基因的杆状病毒杆粒Bacmid-HA,检测核酸浓度后置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.2.3 重组杆状病毒的拯救 将处于对数生长期的Sf9昆虫细胞以1×106个细胞每孔的密度接种至6孔细胞培养板,置于27℃温箱培养2 h,取3 μg的杆粒Bacmid-HA,以脂质体转染的方式将杆粒Bacmid-HA转染到Sf9细胞,转染后培养至96 h,细胞经冻融3次后离心取上清,并在Sf9细胞中连续盲传3代,直至产生Sf9细胞变大、漂浮、脱落等明显细胞病变[11]。

1.2.4 间接免疫荧光试验 将收集的杆状病毒病毒液接种重新至Sf9细胞,置于27℃温箱培养72 h后,经4%多聚甲醛固定处理、0.1% Triton X-100细胞透化,分别以anti-Strep鼠源单抗(1∶500稀释)和H5亚型阳性血清(1∶250稀释)为一抗孵育1 h,用PBS洗涤3次,再用FITC标记的羊抗鼠二抗(1∶500稀释)和FITC标记的兔抗鸡二抗(1∶500稀释)孵育1 h,然后置于荧光显微镜下观察[12]。

1.2.5 重组HA蛋白的表达与纯化 收集接种杆状病毒病毒液的Sf9细胞培养上清和细胞总蛋白,通过Western blot试验检测HA蛋白的表达情况。经12% SDS-PAGE电泳、NC膜转印、5%脱脂奶粉封闭后,分别以anti-Strep鼠源单抗(1∶1 000稀释)和H5亚型阳性血清(1∶250稀释)为一抗,羊抗鼠酶标二抗(1∶10 000稀释)和兔抗鸡酶标二抗(1∶10 000稀释)孵育NC膜,以化学发光的方法进行成像。最后通过strep标签亲和层析的方式从Sf9细胞上清中纯化HA重组蛋白。

2 结果

2.1 重组杆状病毒质粒Bacmid-HA的构建

构建的杆状病毒穿梭质粒pFastBac-HA经测序验证完全正确,并且从抗性平板挑取的白色单菌落,可通过PCR检测到大小相似的目的条带(图1),表明重组杆状病毒质粒Bacmid-HA构建成功。

M.DNA标准DL 5 000;1～8.Bacmid-HA菌液PCR鉴定M.DNA Marker DL 5 000; 1-8.PCR identification of Bacmid-HA图1 重组杆状病毒质粒Bacmid-HA的PCR鉴定Fig.1 PCR identification of recombinant baculovirus plasmid Bacmid-HA

2.2 重组杆状病毒的拯救

结果如图2所示,表达H5亚型禽流感病毒HA基因的重组杆状病毒在盲传3代后,可见细胞形态变大、死亡脱落等细胞病变,表明重组杆状病毒拯救成功。分别以anti-Strep鼠源单抗和H5亚型禽流感病毒阳性血清为一抗,进行间接免疫荧光检测,可观察到大约50%～80%的Sf9细胞被绿色荧光着色,表明接种重组杆状病毒后,Sf9细胞可表达特异性目的蛋白(图3)。

A.正常Sf9细胞;B.杆状病毒感染引起的细胞病变A.Normal Sf9 cells; B.Cytopathic effect caused by baculovirus infection图2 重组杆状病毒感染造成的Sf9细胞病变Fig.2 Sf9 cell cytopathic effect caused by recombinant baculovirus

A.以anti-Strep鼠源单抗为一抗孵育;B.以H5阳性血清为一抗孵育;C.空白对照A.Incubation with anti-Strep monoclonal antibody as primary antibody; B.Incubation with H5 positive serum as primary antibody; C.Blank control图3 间接免疫荧光鉴定Fig.3 Indirect immunofluorescence identification

2.3 重组HA蛋白的表达与鉴定

为鉴定感染重组杆状病毒是否表达H5亚型AIVHA蛋白,将重组杆状病毒接种Sf9细胞72h后,收集细胞总蛋白,分别以anti-Strep鼠源单抗和H5阳性血清为一抗,进行Western blot鉴定。结果显示(图4A,图4B),anti-Strep鼠源单抗和H5阳性血清都能与蛋白样品在70 ku蛋白处可出现有一特异性反应条带,大小与预期(65.2 ku)相符,表明Sf9细胞可成功表达H5亚型AIV HA蛋白。

M.蛋白分子质量标准;1.以anti-Strep鼠源单抗为一抗;2.以H5阳性血清为一抗;3.Sf9细胞接毒72 h后细胞破碎沉淀;4.Sf9细胞接毒72 h后细胞培养上清M.Protein molecular weight Marker; 1.Incubation with anti-Strep monoclonal antibody as primary antibody; 2.Incubation with H5 positive serum as primary antibody; 3.Cell fragmentation precipitate of Sf9 72 hours post infection; 4.Cell culture supernatant of Sf9 72 hours post infection图4 H5亚型禽流感病毒HA蛋白的Western blot鉴定Fig.4 Western blot identification of H5 subtype AIV HA protein

为鉴定重组HA蛋白的分泌形式,收集接毒72 h后的细胞总蛋白和细胞培养上清,以anti-Strep鼠源单抗为一抗进行Western blot鉴定,结果显示在Sf9细胞破碎沉淀和细胞培养上清中均可检测到表达HA蛋白(图4C),且Sf9细胞培养上清中鸡红细胞凝集效价为1:64,而空载杆状病毒感染的血凝效价为0(图5A)。

2.4 重组HA蛋白的纯化

采用亲和层析方法对细胞培养上清液进行纯化,使用50 mmol/L碳酸铵,0.5 mol/L NaCl, pH10.0的洗涤液洗涤杂蛋白,使用50 mmol/L乙酸铵,0.5 mol/L NaCl,pH4.0的洗脱液洗脱目的蛋白,纯化后产物经SDS-PAGE电泳(图5B),在70 ku分子质量标准附近可观察到一条明显的目的条带,纯度90%以上,经Bradford法检测HA重组蛋白浓度为0.364 mg/mL。

3 讨论

HA基因编码的血凝素蛋白HA分布在病毒囊膜表面,是决定AIV受体结合特异性的关键蛋白,具有凝集鸡红细胞的作用[2]。当病毒粒子表面的HA蛋白与宿主细胞膜表面的唾液酸受体识别结合后,启动下游信号通路介导病毒粒子通过内吞作用进入胞内[13]。HA蛋白是AIV主要的免疫原性蛋白,在疫苗免疫评价中常通过微量血凝抑制试验法,检测免疫后血清中HA抗体的效价[14]。

目前H5亚型AIV商品化疫苗以鸡胚灭活疫苗为主,但鸡胚生产的传统灭活疫苗存在着外源病毒污染、需要生物安全三级生产车间等缺陷,AIV亚单位疫苗的研发是当前AIV研究热点[15-16]。Ecker等[14]通过哺乳动物细胞表达系统成功实现H1N1 HA蛋白的表达纯化,并且表达的蛋白具有凝集鸡红细胞的生物特性,可适用于大规模蛋白生产,但未评价HA重组蛋白在实验动物中的免疫原性。相比哺乳动物表达系统,杆状病毒-昆虫细胞系统的蛋白表达成本更低,具有一定的糖基化修饰,且可同时高效表达多种蛋白[17]。Yang等[18]利用杆状病毒-昆虫细胞系统,构建可同时表达H5、N6和M1蛋白的病毒样颗粒,该病毒样颗粒在小鼠模型具有良好的抗原性,但尚未评价该病毒样颗粒在SPF鸡中的免疫保护力。类似的,王同燕等[19]也将H9、N2和M1基因的全长片段克隆到杆状病毒穿梭质粒上,拯救重组杆状病毒,并且免疫保护试验证明,该病毒样颗粒制备的疫苗可有效降低H9亚型AIV攻毒导致的SPF鸡排毒。此外仝晓丹等[20]也成功利用杆状病毒表达H5亚型AIV的HA蛋白,并且通过His镍株亲和层析获得可溶性表达的HA。上述试验结果均表明杆状病毒-昆虫细胞系统是一种技术成熟、高效的蛋白表达系统。

为表达具有生物活性的HA蛋白、研制AIV亚单位疫苗,本试验通过杆状病毒在昆虫细胞中表达H5亚型AIV的HA蛋白,并将HA信号肽替换成蜂毒信号肽,以提升分泌表达的水平。与6×组氨酸标签相比,Strep-tag亲和纯化系统具有纯化过程温和、目的蛋白纯度高、特异性强、兼容多种表达系统等优点[21],因此本试验在HA蛋白C端设计Strep-tag标签,以提高重组蛋白的纯度和回收率。最终本试验表达的HA蛋白可以细胞培养上清的形式表达,并且可与Strep标签抗体、H5亚型阳性血清特异性结合,具有良好的生物学活性,可凝集鸡红细胞(血凝效价为1∶64),亲和纯化回收后蛋白浓度为0.364 mg/mL,但与同类报道相比,表达纯化的HA重组蛋白产量较低,需要进一步优化表达条件,且该HA重组蛋白在实验动物中是否具有良好的免疫原性,仍需后续试验证明。本试验可为H5亚型AIV亚单位疫苗研发、HA单克隆抗体制备等后续研究奠定前期基础。