纳米二氧化硅对小鼠肺脏的急性毒性作用

郑 珍,方忞芊,叶蓉蓉,许显玉,2,张金龙,2,陈风雷,2*

(1.扬州大学兽医学院,江苏扬州 225009;2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心,江苏扬州 225009)

随着纳米材料合成技术的迅速发展,纳米二氧化硅(silica nanoparticles,SNPs)作为目前较为广泛使用的纳米材料,具有合成技术成熟、稳定性好、吸附能力强、良好生物相容性和有利于表面改性等特点,在食品、医药、材料和农牧科学等领域应用越来越广泛。然而,随着SNPs使用范围的不断扩大,也逐渐暴露了SNPs对于人类和动物健康及生态环境的毒副作用。SNPs可通过呼吸系统、消化系统、血液和皮肤等多种途径进入机体,因此肺脏、肝脏和肾脏成为SNPs作用的主要靶器官[1]。已有研究表明SNPs可对大鼠心、肝、肺和睾丸组织产生毒副作用[2-4]。SNPs可通过气管滴注的方式导致小鼠肺组织及大鼠肺间质的纤维化[5-6],但通过其他途径暴露的相关研究少之又少。

本文将同等初始发育状态的小鼠随机分组,以不同剂量SNPs通过血液途径暴露后,通过生长状态观察、脏器系数计算、HE和TUNEL染色等方法检测SNPs是否对小鼠生长发育和肺脏器官产生毒副作用,验证本文所用剂量是否为安全使用剂量,从而为SNPs的临床应用和毒性研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 ICR小鼠,28日龄,19.0 g±2.0 g,购于扬州大学比较医学中心,所有实验操作都得到扬州大学动物保护和伦理委员会批准(批准编号:202103322)。

1.1.2 主要试剂 多聚甲醛,4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI),Sigma-Aldrich公司产品;伊红,苏木精,中性树脂,Solarbio公司产品;12% SDS-PAGE凝胶新赛美公司产品;蛋白酶K,TUNEL细胞凋亡检测试剂盒,抗淬灭剂,碧云天生物技术有限公司产品;PVDF膜,ECL发光液,Merck Millipore公司产品。

1.1.3 主要仪器 ASP 300S自动脱水机,EG1150H自动包埋机,RM2255切片机,TCS SP8 STED激光共聚焦显微镜,LEICA公司产品;病理组织漂烘仪,金华市华速科技有限公司产品;透射电镜,FEI公司产品;CX23光学显微镜,BX43荧光倒置显微镜,OLYMPUS公司产品。

1.2 方法

1.2.1 SNPs合成和理化性质检测 参照Stöber方法[7]合成SNPs,将1700 mmol无水乙醇、155 mmol ddH2O和26 mmol氢氧化铵在烧瓶中以400 r/min的搅拌速度混合10 min;然后,滴加16 mmol四乙基原硅酸盐(tetraethyl orthosilicate,TEOS)并将反应在室温下搅拌24 h。使用冷冻超高速离心机以15 000 r/min离心20 min,用ddH2O和95%乙醇彻底洗涤沉淀后在无水乙醇中保存备用。

利用超声(160 W,20 kHz)处理30 min后,滴加该液体至200目铜网中,除去多余液体后烘干,利用透射电镜检测SNPs形态结构并通过Image J 软件 (National Institutes of Health,Bethesda,MD,USA)测定其粒径大小。将样品加入清洗过的专用石英盒中,利用Zetasizer Nano ZS检测在10 mmol/L NaCl中SNPs的流体动力学大小和zeta电位,重复测定3次。

1.2.2 试验用动物SNP处理 贮存的SNPs悬液超声振荡3次,每次20 min,用过滤的生理盐水稀释至所需浓度以备注射,在注射过程中多次超声震荡防止其发生沉淀。36只ICR小鼠按初始体重随机分组为生理盐水注射组(对照组)、12.5 mg/kg SNP处理组、25.0 mg/kg SNP处理组、50.0 mg/kg SNP处理组,每组9只。通过一次性尾静脉注射的方式对各组小鼠注射等量0.2 mL生理盐水或SNPs注射液,于25℃恒温动物房在相同饲喂条件下饲养15 d,隔日定点进行称重并记录,观察小鼠体征以及饮食行为有无异常。

1.2.3 肺脏组织收集 将第15天称重后的小鼠安乐死,表面消毒后打开胸腔,取其肺脏于生理盐水中漂洗去除血迹,各组肺脏以标尺进行测量对比并拍照记录。对肺组织进行称重后左右肺各取相同部分进行4%多聚甲醛固定。

1.2.4 HE染色检测肺脏病理学变化 4%多聚甲醛中的肺脏组织经梯度酒精脱水、二甲苯透明和石蜡包埋后制成5 μm厚度的切片,具体处理流程依次为70%乙醇60 min、80%乙醇60 min、85%乙醇90 min、95% Ⅰ乙醇60 min、95% Ⅱ乙醇40 min、无水乙醇Ⅰ60 min、无水乙醇 Ⅱ 60 min、二甲苯Ⅰ 25 min、二甲苯Ⅱ 25 min、石蜡Ⅰ 60 min、石蜡Ⅱ 60 min和石蜡Ⅲ 60 min。将组织与载玻片完全贴合状态的石蜡切片按照二甲苯Ⅰ 10 min、二甲苯Ⅱ 10min、无水乙醇Ⅰ 5 min、无水乙醇Ⅱ 5 min、95% Ⅰ乙醇3 min、95% Ⅱ乙醇3 min、80%乙醇3 min和70%乙醇3 min的顺序进行脱蜡脱水,经苏木精和伊红染色后继续进行梯度酒精和二甲苯再脱水,最后以中性树脂封片,通过光学显微镜观察并拍照。

1.2.5 TUNEL染色检测肺脏组织细胞凋亡变化 石蜡切片于60℃烘箱放置30 min后进行脱蜡和水化,顺序为二甲苯Ⅰ 10 min、二甲苯Ⅱ 10 min、无水乙醇5 min、90%乙醇2 min、70%乙醇2 min和蒸馏水2 min。组织切片上滴加20 μg/mL不含DNase的蛋白酶K,37℃作用15 min,PBS洗涤3次后,除阴性对照外其余每张切片加新鲜配制的50 μL TUNEL检测液,37℃避光孵育60 min,PBS洗涤3次后滴加DAPI染液于37℃避光处理10 min,再次以PBS洗涤,抗淬灭封片,在激光共聚焦显微镜下观察并拍照。

1.3 统计分析

采用SPSS 18.0 软件进行数据分析,One-way ANOVA方法进行显著性分析,P<0.05为显著差异。

2 结果与分析

2.1 SNPs的理化性质

TEM结果表明SNPs颗粒为单分散球形(图1A)。通过计算得出SNPs尺寸为(106.7±10.1)nm(图1B)。此外,根据课题组前期研究结果SNPs在10 mmol/L NaCl溶液中的流体动力学尺寸为(110.8±26.5)nm及zeta电位为(-49.7±6.6)mV[3]。

注:A.SNPs TEM图;B.图A粒径大小分析图。Note:A.TEM image of SNPs.B.Analysis of size distribution histograms.图1 SNPs理化性质Fig.1 Physicochemical properties of SNPs

2.2 小鼠行为状态、体重增长及肺脏变化分析

SNPs各处理组小鼠精神状态及饮食情况与生理盐水组无显著差异,未出现小鼠死亡现象。记录小鼠15 d体重并制作体重增长曲线,发现SNP处理组和生理盐水组小鼠体重稳定增长,且各组间无统计学差异(图2)。

注:SNPs处理小鼠15日内的体重增长曲线。Note:Body weight gain curves of SNPs treated mice within 15 days.图2 小鼠体重增长情况Fig.2 Body weight gains of the mice

2.3 小鼠肺组织HE染色结果

H&E染色结果显示生理盐水组(对照组)肺泡排列整齐且腔内无出血和肺泡液积聚;肺泡间隙无炎症反应,未见炎性细胞浸润,肺泡壁毛细血管未发生明显扩张(图3A);12.5 mg/kg SNP注射组组织结构分布清晰,与生理盐水组相比未出现明显病理变化(图3B);25.0 mg/kg SNP注射组肺泡间隔出现增厚现象(图3C);50.0 mg/kg SNP注射组除肺泡间隔明显增厚外,还出现肺泡腔融合与炎性渗出现象(图3D)。

A.生理盐水组(对照组);B.12.5 mg/kg SNP注射组;C.25.0 mg/kg SNP注射组;D.50.0 mg/kg SNP注射组;标尺:20 μm;黑色箭头指示肺泡间隔增厚,白色箭头指示肺泡内炎性渗出物。A.Saline group (Control group); B.12.5 mg/kg SNP injection group; C.25.0 mg/kg SNP injection group; D.50.0 mg/kg SNP injection group; Scale bar,20 μm; Black arrows indicate thickening of the alveolar septum,white arrows indicate inflammatory exudates in the alveoli.图3 小鼠肺组织HE染色结果Fig.3 HE stain result of mouse lung tissue

2.4 SNPs诱导肺脏组织细胞凋亡

为了检测SNPs是否引起肺脏组织细胞的凋亡,将制作好的石蜡切片进行TUNEL染色。TUNEL染色结果表明生理盐水组肺组织切片的细胞核均被染为蓝色,无绿色荧光,表明未发生细胞凋亡(图4Aa-Ac);12.5、25.0、50.0 mg/kg SNP注射组出现少数绿色荧光,表明SNP处理组细胞出现凋亡现象(图4Ba-Dc)。

Aa-Dc.激光共聚焦检测不同剂量SNPs处理后肺组织细胞凋亡情况,生理盐水组(Aa-Ac)、12.5 mg/kg SNP注射组(Ba-Bc)、25.0 mg/kg SNP注射组(Ca-Cc)和50.0 mg/kg SNP注射组(Da-Dc),标尺:50 μm。Aa-Dc.Laser confocal detection of lung cell apoptosis after SNPs treatment.Aa-Ac.Normal saline group; Ba-Bc.12.5 mg/kg SNP injection group; Ca-Cc.25.0 mg/kg SNP injection group; Da-Dc.50.0 mg/kg SNP injection group,scale bar,50 μm.图4 SNPs对小鼠肺组织细胞凋亡的影响Fig.4 Effects of SNPs on apoptosis of mouse lung tissue cells

3 讨论

SNPs是一种直径小于100 nm的粒子,由于其具有独特的理化性质和良好的生物相容性,成为目前应用较为广泛的新兴纳米材料之一[8]。SNPs可用于成像和药物监测,混合磁性纳米二氧化硅(magnetic silica nanoparticles,MSNs)被用作下一代磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)造影剂,SNPs装载药物如链霉素等进行生物递送大大提高了药物利用率,以SNPs为佐剂制备的糖蛋白85(glycoprotein 85)蛋白疫苗可有效对抗禽白血病病毒[9-12]。但随着其使用领域不断扩展,SNPs对于健康的危害也逐渐显现出来,并引起了高度关注。研究表明,SNPs可通过呼吸系统、消化系统、皮肤和血液等途径进入机体[13]。SNPs相关毒性研究显示,SNPs暴露后会出现严重的心肌损伤,心输出量、收缩力和心率等降低情况,同时心肌细胞发生坏死;摄入SNPs后大鼠肝和肾发生氧化应激,进而造成组织损伤[14-15]。肺脏作为SNPs暴露的直接靶器官之一,可通过吸入方式受到损伤,因此肺脏是SNPs毒性研究热点。研究证实,支气管灌注SNPs会引发小鼠肺部炎症,严重会导致肺纤维化;急性暴露于SNPs会增加小鼠肺通透性,增加小鼠对致命性肺炎的易感性[16-18]。目前,SNPs在疾病治疗及其他药物递送等方面发挥的佐剂作用日益广泛,其摄入方式也逐渐多样化,但皮肤与血液暴露方式的毒性研究相对较少,也成为纳米材料临床应用亟待探讨的问题。

在本试验中,我们采用了单分散性好实心SNPs粒子以尾静脉注射的方式对小鼠进行15 d急性处理,结果显示12.5 mg/kg SNPs处理后小鼠的生长发育和脏器形态等方面与生理盐水组无显著差异,表明该剂量作用下SNPs不会对机体正常生长发育造成影响。将取得的肺组织进行切片制作并进行凋亡相关检测,发现随剂量增加,25.0和50.0 mg/kg剂量下出现肺泡间隔增厚,且50.0 mg/kg SNP处理组出现炎性渗出现象。TUNEL染色结果显示随SNPs剂量增加,细胞出现零星凋亡,表明12.5、25.0和50.0 mg/kg SNP处理无显著促凋亡作用但对肺脏产生了一定的毒副作用。相关研究表明,纳米材料毒性与其表面电荷、形态结构以及尺度大小密切相关[19]。王明祥等[20]对小鼠进行小尺度SNPs染毒处理,发现其肺脏出现明显水肿与浸润现象,导致肺损伤;李明月等[21]发现纳米二氧化硅可导致大鼠肺脏发生明显纤维化,而本文所采用的SNPs对小鼠毒性较低。因此,将该颗粒用于体内试验时,可参考12.5 mg/kg作为安全使用浓度。但本文实验设计尚有需要改进之处,如动物暴露于SNPs环境且可能受到其影响的情况多为长期效应导致,故也应探讨低剂量长期暴露造成的毒理效应;相同SNPs粒子以不同摄入方式对机体和肺脏是否产生不同毒性影响的问题也应进一步探索。在后续实验中将采用更多探究途径,多方面研究SNPs对小鼠肺脏的毒性作用,从而为SNPs纳米颗粒的毒副作用研究提供更为全面的理论依据。

本研究表明SNPs通过尾静脉注射方法急性处理小鼠后引起肺脏组织肺泡间隔增厚和炎性渗出现象。